$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Utrzymanie hodowli komórek mikrogleju
- Pożywka do hodowli komórkowych w ciepłych komórkach (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną/neomycyną (PSN) do 37 °C.
- Otrzymać zamrożony materiał komórek mikrogleju BV2 w pasażu 18-25 z przechowywania w temperaturze -80 °C. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Delikatnie przenieść komórki do kolby z wentylacją o średnicy 75cm2 zawierającej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych.
- Inkubować kolbę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką. Hoduj komórki do około 70-80% zbieżności.
2. Liczenie i powlekanie komórek
- W łaźni wodnej o temperaturze 37 °C ciepły roztwór DMEM i 1x-trypsyna-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA).
- Odessać pożywkę z komórek i dodać 500 μl trypsyny. Inkubować w temperaturze 37°C przez 2 - 5 minut.
- Za pomocą skrobaka usunąć komórki z kolby i zawiesić w 5 ml DMEM. Przepuścić komórki przez sitko o średnicy 70 μm do probówki o pojemności 50 ml trzy razy.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 8 000 komórek / studzienkę na przezroczystej płytce dolnej o czarnych ściankach w końcowej objętości 200 μl DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% PSN. Inkubować płytkę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
- Usuń stary DMEM i zastąp go 200 μl podgrzanego DMEM uzupełnionego 1% PSN, aby surowicy głodzą mikrogleju. Inkubować płytkę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
3. Aktywacja mikrogleju
- W oddzielnych probówkach rozcieńczyć nanocząstki srebra (AgNPs) (0,01, 0,05 lub 0,1 μg/ml) i kontrolę nośnika/obojętnego (cytrynian sodu, 0,04 mM) w DMEM bez surowicy uzupełnionym 1% PSN do końcowych stężeń roboczych.
- Usunąć 100 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 100 μl odpowiedniego środka do uzdatniania.
- Inkubować płytkę w 5 % CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
4. Filtrowanie mediów kondycjonowanych
- Zebrać 200 μl supernatantu pożywki z każdej studzienki i przenieść go do filtra (odcięcie masy cząsteczkowej 10 kDa) z probówką zbiorczą (pojemność 1,5 do 2 ml).
- Wirować przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej przez 15 min.
- Wyrzuć przepływowy (supernatant z cząstkami) i umieść filtr do góry nogami w nowej probówce zbiorczej.
- Wirować przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej przez 2 min.
nuta: Powstałe przefiltrowane pożywki (zawierające wydzielane cytokiny) są skoncentrowane sześciokrotnie.
- Doprowadzić objętość koncentratu do 400 μl za pomocą świeżego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% PSN i przechowywać na lodzie.
5. Utrzymanie hodowli komórek podwzgórza
- Ciepła pożywka do hodowli komórkowych DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% PSN do 37 °C.
- Otrzymać zamrożony zapas komórek podwzgórza (mHypo-A1/2) w czasie pasażu 18-25, przechowywany w temperaturze 80 °C. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Delikatnie przenieść komórki do kolby z wentylacją o średnicy 75cm2 zawierającej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych.
- Inkubować kolbę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką. Hoduj komórki, aż osiągną około 70-80% zbieżności.
6. Określanie toksyczności komórek podwzgórza
- Ciepły roztwór DMEM i 1x-trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Odessać pożywkę z komórek podwzgórza i dodać 500 μl trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 - 5 minut. Usunąć komórki z kolby za pomocą skrobaka, jak opisano powyżej w kroku 2.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytkuj komórki podwzgórza w 5 000 komórek/studzienkę na przezroczystej płytce dolnej o czarnych ściankach w końcowej objętości 200 μl DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% PSN i inkubuj przez noc w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Usunąć 100 μl starych pożywek za pomocą pipetora wielokanałowego i dodać 100 μl przefiltrowanych, skoncentrowanych kondycjonowanych pożywek do końcowego stężenia 1x.
- Inkubować płytkę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
- Dodać 22 μl odczynnika rezazuryny i inkubować płytkę przez 20 minut w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Za pomocą spektrofotometru wielomodowego zarejestruj fluorescencję (560 nm EX/590 nm EM) w celu zmierzenia żywotności komórek. Raportuj wyniki jako względne jednostki fluorescencji (RFU).