Określanie toksyczności neuronów wywołanej przez nanocząstki przy użyciu mikrogleju jako zastępczego bioczujnika

Streszczenie

Źródło: Duffy, C. M. et al., Microglej jako zastępczy bioczujnik do określania neurotoksyczności nanocząstek.J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje metodę oceny neurotoksycznych efektów nanocząsteczek za pomocą mikrogleju. Przedstawiono w nim etapy aktywacji mikrogleju za pomocą nanocząstek, filtrowania kondycjonowanych pożywek w celu wyizolowania cytokin prozapalnych pochodzących z mikrogleju oraz testowania toksyczności neuronów podwzgórza za pomocą kondycjonowanych pożywek.

Protokół

1. Utrzymanie hodowli komórek mikrogleju

1. Pożywka do hodowli komórkowych w ciepłych komórkach (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną/neomycyną (PSN) do 37 °C.
2. Otrzymać zamrożony materiał komórek mikrogleju BV2 w pasażu 18-25 z przechowywania w temperaturze -80 °C. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Delikatnie przenieść komórki do kolby z wentylacją o średnicy 75^cm2 zawierającej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych.
4. Inkubować kolbę w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką. Hoduj komórki do około 70-80% zbieżności.

2. Liczenie i powlekanie komórek

1. W łaźni wodnej o temperaturze 37 °C ciepły roztwór DMEM i 1x-trypsyna-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA).
2. Odessać pożywkę z komórek i dodać 500 μl trypsyny. Inkubować w temperaturze 37°C przez 2 - 5 minut.
3. Za pomocą skrobaka usunąć komórki z kolby i zawiesić w 5 ml DMEM. Przepuścić komórki przez sitko o średnicy 70 μm do probówki o pojemności 50 ml trzy razy.
4. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 8 000 komórek / studzienkę na przezroczystej płytce dolnej o czarnych ściankach w końcowej objętości 200 μl DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% PSN. Inkubować płytkę w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
5. Usuń stary DMEM i zastąp go 200 μl podgrzanego DMEM uzupełnionego 1% PSN, aby surowicy głodzą mikrogleju. Inkubować płytkę w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

3. Aktywacja mikrogleju

1. W oddzielnych probówkach rozcieńczyć nanocząstki srebra (AgNPs) (0,01, 0,05 lub 0,1 μg/ml) i kontrolę nośnika/obojętnego (cytrynian sodu, 0,04 mM) w DMEM bez surowicy uzupełnionym 1% PSN do końcowych stężeń roboczych.
2. Usunąć 100 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 100 μl odpowiedniego środka do uzdatniania.
3. Inkubować płytkę w 5 % CO₂ w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

4. Filtrowanie mediów kondycjonowanych

1. Zebrać 200 μl supernatantu pożywki z każdej studzienki i przenieść go do filtra (odcięcie masy cząsteczkowej 10 kDa) z probówką zbiorczą (pojemność 1,5 do 2 ml).
2. Wirować przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej przez 15 min.
3. Wyrzuć przepływowy (supernatant z cząstkami) i umieść filtr do góry nogami w nowej probówce zbiorczej.
4. Wirować przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej przez 2 min.
   nuta: Powstałe przefiltrowane pożywki (zawierające wydzielane cytokiny) są skoncentrowane sześciokrotnie.
5. Doprowadzić objętość koncentratu do 400 μl za pomocą świeżego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% PSN i przechowywać na lodzie.

5. Utrzymanie hodowli komórek podwzgórza

1. Ciepła pożywka do hodowli komórkowych DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% PSN do 37 °C.
2. Otrzymać zamrożony zapas komórek podwzgórza (mHypo-A1/2) w czasie pasażu 18-25, przechowywany w temperaturze 80 °C. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Delikatnie przenieść komórki do kolby z wentylacją o średnicy 75^cm2 zawierającej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych.
4. Inkubować kolbę w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką. Hoduj komórki, aż osiągną około 70-80% zbieżności.

6. Określanie toksyczności komórek podwzgórza

1. Ciepły roztwór DMEM i 1x-trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Odessać pożywkę z komórek podwzgórza i dodać 500 μl trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 - 5 minut. Usunąć komórki z kolby za pomocą skrobaka, jak opisano powyżej w kroku 2.
3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytkuj komórki podwzgórza w 5 000 komórek/studzienkę na przezroczystej płytce dolnej o czarnych ściankach w końcowej objętości 200 μl DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% PSN i inkubuj przez noc w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
4. Usunąć 100 μl starych pożywek za pomocą pipetora wielokanałowego i dodać 100 μl przefiltrowanych, skoncentrowanych kondycjonowanych pożywek do końcowego stężenia 1x.
5. Inkubować płytkę w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
6. Dodać 22 μl odczynnika rezazuryny i inkubować płytkę przez 20 minut w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
7. Za pomocą spektrofotometru wielomodowego zarejestruj fluorescencję (560 nm EX/590 nm EM) w celu zmierzenia żywotności komórek. Raportuj wyniki jako względne jednostki fluorescencji (RFU).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki/odczynniki
Mysia linia komórkowa mikrogleju (BV2)	Interlab Cell Line Collection (Genua, Włochy)	ATL03001
Linia komórkowa podwzgórza dorosłej myszy mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Zmodyfikowany Medium Orła Dulbecco	Invitrogen	Numer katalogowy: 10313-039
Surowica bydlęca płodu	Laboratoria PAA	A15-751
Penicylina/Streptomycyna/Neomycyna	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 15640-055
Trypsyna-EDTA	Thermo Fisher Naukowy	25200056
Nanocząstki srebra (20nm)	Sigma-Aldrich	730793
Odczynnik do żywotności komórek PrestoBlue	Invitrogen	A13262
Mysz TNF-α ELISA Max Delux	Legenda biologiczna	430904
Lipopolisacharyd	Sigma-Aldrich	L4391
Cytrynian sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S4641
sprzęt
Dolna płyta optyczna 96 W, polistyren, poddany hodowli komórkowej, z pokrywką, sterylny	Thermo Fisher Naukowy	165305
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0.5 z membraną Ultracel-10	EMD Milipore	UFC501008
SpectraMax M5 Mikropłytka wielomodowa	Urządzenia molekularne	Zobacz materiał M5
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml	Corning, Inc	Numer katalogowy: 14-432-22
Sitka Falcon Cell 70 μm	Corning, Inc	Numer katalogowy: 08-771-2
Wirówka stołowa 5430	Eppendorf	22620560

powiedział: powiedział: