1. Przygotowanie odczynników i sprzętu
- Przygotować 1x Bufor preparacyjny (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sacharozy, 5 mM trehalozy, 5 mM hydroksyetylopiperazyny, kwas etanosulfonowy [HEPES]; pH 7,2).
- Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Przygotuj 1x PBT za pomocą 1x PBS z 0,01% Triton X-100.
- Przygotuj talerze agarowe z sokiem owocowym.14 Krótko wymieszaj 30 g agaru w 700 mlH2Oi autoklawie. Rozpuścić 0,5 g metyloparabena w 10 ml etanolu i dodać roztwór do 300 ml koncentratu soku owocowego (winogronowego lub jabłkowego). Wymieszać koncentrat z autoklalawowanym roztworem agaru i przelać do pokrywek szalek Petriego o wymiarach 10 mm x 35 mm.
nuta: Premiks energetyczny z agarem winogronowym można również kupić w różnych firmach (patrz tabela materiałów).
- Zaopatrz się w kleszcze w rozmiarze 5, które pozwolą na mechaniczne zranienie larw.
- Używaj standardowego aparatu anestezjologicznego opartego na Drosophila CO2.
2. Wybór larw Drosophila
- Pobrać fiolkę lub butelkę Drosophila zawierającą wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego, które zostały wyhodowane w temperaturze 25 °C.
- Wybierz dziesięć pojedynczych larw w 2. lub 3. stadium na podstawie wyglądu. Larwy w trzecim stadium można rozpoznać po wyglądzie przednich rozgałęzionych przetchlinek, podczas gdy larwy w drugim stadium są mniejsze i mają bardziej maczugowe przetchlinki przednie.
nuta: Stadia larwalne można również zidentyfikować na podstawie czasu. W temperaturze 25 °C larwy drugiego stadium rozwojowego pojawiają się około 48 godzin po wykluciu, a larwy trzeciego stadium linieją około 24 godziny później. Jeśli jesteś zainteresowany badaniem neurodegeneracji w NMJ, larwy drugiego stadium muszą zostać zranione.
3. Przygotowanie larw Drosophila do mechanicznego zranienia
- Ostrożnie podnoś pojedyncze larwy kleszczami lub pędzlem, uważając, aby w żaden sposób ich nie ściskać.
- Bezpośrednio umieść dziesięć larw w szklanym naczyniu zawierającym zimny 1X PBS lub bufor do preparacji, aby usunąć wszelkie resztki jedzenia i spowolnić ruchliwość larw.
4. Mechaniczne urazy i leczenie larw Drosophila
- Umieść każdą pojedynczą larwę na aparacie znieczulającym CO2 .
- Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie przetocz każdą larwę na stronę grzbietową, aby uwidocznić nerwy segmentowe przez naskórek.
- Pozycja rozmiar 5 kleszcze około 1/2 do 2/3 długości larwy, zaczynając od haczyków gębowych. Po ustawieniu ściśnij około 1/3 naskórka brzusznego zawierającego nerwy segmentowe za pomocą kleszczyków o rozmiarze 5.
- Aby upewnić się, że nerwy segmentowe larw są uszkodzone, należy zastosować wystarczającą siłę, aby zmiażdżyć nerwy segmentowe, ale pozostawić naskórek nienaruszony. Aby określić prawidłową siłę działania, zmiażdż 10 larw i upewnij się, że śmiertelność po 5 godzinach wynosi poniżej 50%.
- Po urazie ostrożnie przenieś larwy na talerz agarowy z sokiem owocowym zawierający około 0,5 g pasty drożdżowej. Umieść każdą larwę tak, aby jej przedni koniec znajdował się na paście drożdżowej, aby kontynuować karmienie pomimo zakłóconej ruchliwości.
nuta: Aby upewnić się, że nerwy segmentowe larw zostały uszkodzone, po przeniesieniu na płytkę agarową można zaobserwować zakłóconą ruchliwość larw. Zranione larwy są skutecznie sparaliżowane z tyłu w stosunku do miejsca urazu, ale nadal mogą poruszać haczykami do ust i żerować. Wysoka śmiertelność zwierząt po zranieniu jest powszechna, dlatego najlepiej jest zranić 20-50% więcej zwierząt, niż jest to konieczne do przeprowadzenia eksperymentu.
- Umieść płytki agarowe zawierające pastę drożdżową i 10 zranionych larw na dnie pustej szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm. Przykryj tę płytkę Petriego, teraz zawierającą zranione larwy na płytce agarowej, wilgotnym ręcznikiem papierowym, upewniając się, że ręcznik papierowy nie dotyka larw ani płytek agarowych. Umieść tę szalkę Petriego w większym, hermetycznym pojemniku w temperaturze pokojowej (RT).
- Pobrać larwy do sekcji po określonych okresach (6, 12 lub 24 godzin) po urazie.
nuta: Aby zbadać natychmiastowy wpływ urazu na cytoszkielet aksonalny, larwy można wypreparować bezpośrednio po urazie. W celu zbadania wad transportu aksonalnego larwy można wypreparować około 6 godzin po urazie. Po około 12 godzinach od urazu można zaobserwować nagromadzenie ubikwitynowanych białek, a po 24 godzinach od urazu można zaobserwować zwyrodnienie neuronów ruchowych w NMJ.