Generowanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Abstract

Źródło: Tietz, S. M. et al. Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego In Vivo. J. Vis. Exp.(2019 rok)

Ten film demonstruje metodę wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) poprzez wstrzykiwanie peptydów pochodzących z mieliny z adiuwantem w celu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T, które migrują do mózgu. Toksyna krztuścowa jest podawana w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając tym limfocytom T i innym komórkom odpornościowym przedostanie się do mózgu. Te komórki odpornościowe powodują demielinizację, co prowadzi do upośledzenia przekaźnictwa nerwowego i rozwoju EAE.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Indukcja EAE

1. Znieczulenie myszy C57BL/6 izofluoranem za pomocą systemu parownika. Aby wywołać znieczulenie u myszy, wystaw mysz na działanie 4,5% izofluoranu w tlenie w małej komorze inkubacyjnej przed przeniesieniem myszy na maskę na twarz z 2,1% izofluoranem. Użyj jednostki anestezjologicznej wyposażonej w poduszkę grzewczą, aby zapobiec hipotermii myszy.
2. Zamocuj znieczuloną mysz w jednej ręce i najpierw wstrzyknij 30 μl peptydu glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych (MOG) aa_35-55 (MOG_35-55) / kompletną emulsję adiuwantową Freunda (CFA) podskórnie w boki tylnych nóg (ryc. 1: 1 + 2; łącznie 60 μl; lewy bok 30 μl i prawy bok 30 μl) w bliskiej odległości od pachwinowych węzłów chłonnych.
3. Umieść mysz na brzuchu i wstrzyknij 20 μl emulsji MOGaa_35-55/CFA w lewą i prawą miękką tkankę tłuszczową u nasady ogona (Rysunek 1: 3 + 4; łącznie 40 μL; nasada ogona po lewej stronie 20 μl i korzeń ogona po prawej stronie 20 μL) i niewielką kropelkę emulsji MOGaa_35-55/CFA w szyję myszy (Rysunek 1: 5).
4. Wstrzyknąć dootrzewnowo myszu 100 μl roztworu toksyny krztuścowej (PTx). Trzymaj głowę myszy poniżej środka ciała, aby uniknąć wstrzyknięcia do jelita.
5. Zastąp dietę konserwacyjną (ekstruduj główne składniki odżywcze: białko surowe 18,5%; tłuszcz surowy 4,5%; włókno surowe 4,5%; popiół surowy 6,5%; skrobia 35%; energia metaboliczna: 13,1 MJ/kg) na dietę hodowlaną (ekstruduj główne składniki odżywcze: białko surowe 23,5%; tłuszcz surowy 5,5%; włókno surowe 3%; popiół surowy 5,7%; skrobia 36%; energia metaboliczna: 14,3 MJ/kg) w celu dostarczenia myszom pokarmu o wyższej zawartości energii przed i w trakcie spodziewanej choroby klinicznej.
6. Zdejmij maskę na twarz i przenieś mysz do klatki domowej z podkładką rozgrzewającą. Po 10 minutach upewnij się, że mysz jest w pełni obudzona i ruchliwa.
7. Powtórzyć wstrzyknięcie PTx (krok 1.4) 48 godzin po pierwszym zabiegu.

2. Punktacja myszy EAE

1. Każdego ranka sprawdzaj stan zdrowia myszy EAE, zaglądając do wnętrza klatek.
2. Oceniaj myszy EAE każdego popołudnia.
3. Wyjmij z klatki każdą pojedynczą mysz biorącą udział w eksperymencie EAE i sprawdź, czy ogon ma tonus, przesuwając go palcem w górę. Zdrowa mysz będzie trzymać ogon w górze (ogon ma tonus). Jeśli rozpoczął się kliniczny EAE, tonus ogonowy będzie niższy, widoczny przez stopniowe opadanie ogona. W końcu mysz nie będzie w stanie w ogóle podnieść ogona.
4. Umieść każdą pojedynczą mysz biorącą udział w eksperymencie EAE na czystej ławce i obserwuj oraz dokumentuj zachowanie podczas chodzenia. W tabeli 1 przedstawiono kryteria punktacji do oceny ciężkości choroby (punktacja EAE).
5. Oceń i udokumentuj wagę każdej myszy biorącej udział w eksperymencie.
6. Aby zapewnić odpowiednie pobieranie pokarmu i wody przez myszy wykazujące kliniczny wynik EAE równy 1, należy dostarczać zwilżoną karmę w plastikowym naczyniu na dnie klatki i codziennie odświeżać.

Results

Rysunek 1: Graficzne przedstawienie miejsc iniekcji do indukcji EAE. 1) miejsce wstrzyknięcia 30 μl emulsji MOG w prawą flankę, 2) miejsce wstrzyknięcia 30 μl emulsji MOG w lewą flankę, 3) miejsce wstrzyknięcia 20 μl emulsji MOG do lewego korzenia ogonowego, 4) miejsce wstrzyknięcia 30 μl emulsji MOG do prawego korzenia ogonowego, 5) miejsce wstrzyknięcia niewielkiej kropli emulsji MOG do szyjki. <...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Karma hodowlana	np. PROVIMI KLIBA SA	3336
Klatki wentylowane indywidualnie, linia niebieska typu II lub III	np. Tecniplast	1145T, 1285L
Samice myszy C57BL/6J (8-12 tygodni)	np. Janvier Labs		Suki, 8-12 tygodni
Igła iniekcyjna 18G x 11/2'' (1,2 mm x 40 mm)	np. BD, BD Microlance 3	304622
27G x 3/4'' – nr 20 (0,4mm x 19mm) igły iniekcyjnej	np. BD, BD Microlance 3	Numer katalogowy: 302200
Igła iniekcyjna 30G x 1/2'' (0,3 mm x 13 mm)	np. BD, BD Microlance 3	304000
Niekompletny adiuwant Freunda (IFA)	np. Santa Cruz Biotechnology	SC-24648	Przechowywać w temperaturze 4°C
Żywność pielęgnacyjna	np. PROVIMI KLIBA SA	Numer katalogowy: 3436
Peptyd MOGaa35-55	np. GenScript		Przechowywać w temperaturze -80 °C
Mycobacterium tuberculosis H37RA	np. BD	231141	Przechowywać w temperaturze 4 °C
NaCl: 0.9 %	B. Brauna	3535789
Omnican 50 30G x 1/2''	B. Brauna	9151125S
Toksyna krztuścowa	np. Lista laboratoriów biologicznych, Inc.	180	Przechowywać w temperaturze 4 °C
Nożyczki do ściegów	F.S.T	Numer katalogowy 15012-12
strzykawka 1 ml	np. PRIMO	62.1002
strzykawka 10 ml	np. CODAN Medical ApS	2022-05