Określanie przerwania bariery krew-mózg za pomocą barwników fluorescencyjnych w mysim modelu EAE

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Test przepuszczalności in vivo

1. Przygotowanie roztworów:
   1. W przypadku roztworów podstawowych dekstranu rozpuścić 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 oraz 3 kDa Dextran Texas Red w 500 μl 0,9% roztworu chlorku sodu (20 mg/ml).
   2. W przypadku roztworu roboczego dekstranu, tuż przed wstrzyknięciem, odpipetować 55 μl roztworu podstawowego 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 (20 mg/ml) na kawałek folii uszczelniającej i dodać 55 μl roztworu podstawowego dekstranu Texas Red o stężeniu 3 kDa (20 mg/ml). Wymieszać i zebrać 100 μl do jednorazowej drobnej strzykawki (końcowe stężenie 2 mg/100 μl).
   3. W przypadku 10% roztworu podstawowego formaldehydu (paraformaldehydu lub PFA) należy połączyć 10 g ekstra czystego proszku PFA, 100 ml PBS i 200 μl 1N wodorotlenku sodu (NaOH) w czystej szklanej zlewce i podgrzać dokładnie do 56 °C podczas mieszania za pomocą mieszadła magnetycznego. Przechowywać w temperaturze 56 °C przez 30 minut, aż PFA całkowicie się rozpuści. Schłodzić do temperatury pokojowej, dostosować pH do 7,4 i przefiltrować przez filtr papierowy. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Roztwór podstawowy można dalej rozcieńczać za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS.
2. Krótko znieczulij zdrowe myszy C57BL/6 lub myszy C57BL/6 cierpiące na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego lub EAE izofluranem (mysz będzie uspokojona przez około 1 minutę). Użyj zautomatyzowanego systemu (myszy zostaną wystawione na działanie 4,5% izofluranu w tlenie w komorze indukcyjnej, a następnie przeniesione do maski na twarz z 2,1% izofluranem).
3. Umieść znieczuloną mysz w pozycji bocznej na stole, a następnie dożylnie (np. retroorbitalnie) wstrzyknij myszowi 100 μl fluorescencyjnych znaczników, zanim mysz się obudzi.
4. Natychmiast zdejmij maskę na twarz i upewnij się, że mysz jest w pełni przytomna i ruchliwa po krótkim znieczuleniu. Pozwól znacznikowi krążyć przez 15 minut.