Barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy

Streszczenie

Źródło: Yang, J., et al., Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy i nieodwapnionych kości. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne kriosekcji z embrionalnych tkanek twarzoczaszki myszy, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej do oceny ekspresji markerów jądrowych oraz określenia proliferacji komórek i aktywności sygnalizacyjnej.

Protokół

Tekst zastrzeżenia: Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiedni komitet ds. oceny etyki zwierząt.

1. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Wyjmij szkiełka w temperaturze od -80 °C. Utrzymuj szkiełka w temperaturze RT przez 1 godzinę, aby wyschły na powietrzu. Przepłukać szkiełka w 0,1% PBST (0,1% eterze tert-oktylofenylowym glikolu polietylenowego w PBS; patrz tabela materiałów) trzy razy przez 5 minut każdy, aby wypłukać skrawki OCT i przepuszczalności.
2. Opcjonalnie wykonaj pobieranie antygenu (opcjonalnie).
   1. Podgrzewać bufor cytrynianowy (10 mM cytrynianu sodu o pH 6) w naczyniu barwiącym w naczyniu do gotowania na parze lub w łaźni wodnej do temperatury 95–100 °C. Zanurzyć szkiełka w buforze cytrynianowym i inkubować przez 10 minut.
   2. Wyjmij naczynie do barwienia z naczynia do gotowania na parze lub łaźni wodnej i schładzaj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 20 minut lub dłużej15.
      nuta: Jako alternatywę należy użyć buforu Tris-EDTA (10 mM zasady Tris, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9,0) lub buforu EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8,0) do pobierania antygenu pod wpływem ciepła. Oprócz gorącego parowaru używaj szybkowaru, kuchenki mikrofalowej lub łaźni wodnej do pobierania antygenu pod wpływem ciepła. Inną alternatywą jest indukowane enzymatycznie pobieranie antygenu za pomocą trypsyny lub pepsyny. Zoptymalizuj stężenie i czas obróbki pobierania enzymatycznego, aby uniknąć uszkodzenia skrawków. Zoptymalizuj metodę pobierania antygenu dla każdej kombinacji przeciwciało/antygen.
3. Inkubować każde szkiełko z 200 μl roztworu blokującego (5% surowicy osła rozcieńczonej w 0,1% PBST) w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie usunąć roztwór blokujący bez spłukiwania.
4. Inkubować każde szkiełko ze 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała lub przeciwciał rozcieńczonych w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C. Przepłukać szkiełka podstawowe za pomocą PBS trzy razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Inkubować każde szkiełko z 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełka w PBS trzy razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Chronić szkiełka przed światłem.
6. Zamontuj zjeżdżalnie.
   1. Dodaj dwie krople pożywki zapobiegającej blaknięciu z DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindol) na szkiełko. Następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
   2. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu przygotowania do wykonania zdjęcia.
      nuta: Alternatywnie, najpierw oznacz jądra barwnikiem DAPI lub Hoechst 33324 rozcieńczonym w stosunku 1:2,000 w PBS w temperaturze pokojowej, a następnie połącz glicerolem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało wtórne przeciwko królikowi Alexa fluor 488-koza	Invitrogen	A-11034
Mocowanie zapobiegające blaknięciu z DAPI	Invitrogen	Zobacz materiał P36931
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	Certyfikat A2153
Szkiełka nakrywkowe	Marka Fisher	12-545-E
Kriostat	Księga Leica	Zobacz materiał CM1850
Edta	Sigma	E6758
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus	Zobacz materiał BX51
Szkiełka mikroskopowe	Marka Fisher	Numer katalogowy 12-550-15
Związek OCT	Fisher Opieka zdrowotna	23-730-571
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma	Zobacz materiał P6148
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma	Zobacz materiał P4417
Eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego	Sigma	Zobacz materiał T9284	Tryton X-100
Przeciwciało królika anty-Ki67	Technologia sygnalizacji komórkowej	Numer katalogowy 9129	Działka#:3; RRID:AB_2687446
Królicze przeciwciało anty-pSmad1/5/9	Technologia sygnalizacji komórkowej	Numer katalogowy: 13820	Działka#:3; RRID:AB_2493181
Cytrynian sodu	Sigma	1613859
Tris	Sigma	10708976001

powiedział: