Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Abstract

Źródło: Tsuruta, F., et al. Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Protocol

1. Obrazowanie ruchliwości pęcherzyków

1. Przygotuj plazmidy, które oznaczą każdy rodzaj pęcherzyka. Na przykład użyj EGFP-Rab5 dla wczesnych endosomów, EGFP-Rab7 dla późnych endosomów, LAMP-EGFP dla lizosomów i EGFP-LC3 dla autofagosomów.
   nuta: Plazmidy te są dostępne na życzenie w tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Zazwyczaj 3-5 dni neurony in vitro (Division lub DIV) mogą być transfekowane tymi plazmidami przy użyciu odczynników do transfekcji.
2. Zmieszać 4,0 μg plazmidów z 200 μl pożywki bez surowicy przez pipetowanie. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 8 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) w 200 μl pożywki wolnej od surowicy. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Zmieszać roztwór plazmidu i roztwór regenta do transfekcji w kroku 1.2 przez pipetowanie. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dodać pożywkę bez surowicy i 400 μl roztworu plazmidu z kroku 1.3 do każdego powlekanego naczynia ze szklanym dnem zawierającego neurony korowe pożywki do hodowli kory mózgowej. Inkubować neurony w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO_{2 przez} 30 minut. Zastąp pożywkę 2 ml pożywki do hodowli kory mózgowej. Inkubować neurony w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂ przez 1-2 dni.
   nuta: Przygotuj pożywkę do hodowli kory mózgowej składającą się z podłoża podstawowego neuronów uzupełnionego 1x suplementami B-27, 2 mM L-glutaminą i 100 U / ml penicyliny-streptomycyny.
5. Po 1-2 dniach od transfekcji wybierz transfekowane komórki do akwizycji obrazu.
   nuta: Wcześniaki neuronów poniżej 7 DIV mają tendencję do wykazywania dynamicznej ruchliwości pęcherzyków. Wybierz neurony, które umiarkowanie wyrażają sondę fluorescencyjną, ponieważ nie można uzyskać wyraźnych obrazów, gdy wybrany jest neuron o wysokiej ekspresji. Wybierz również typowy kształt neuronu, taki jak neurony piramidowe, które mają długie aksony i skomplikowane dendryty, aby ułatwić identyfikację aksonu i dendrytów (patrz ryc. 1A).
6. Akwizycja obrazu za pomocą systemu obrazowania poklatkowego: Do obrazowania należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD (Charge-Coupled Device) z soczewkami obiektywowymi 40X Plan Apo 0.95NA lub 100X Plan Apo VC NA1.4. Kontrolować temperaturę 37 °C za pomocą systemu inkubacji. Rejestruj obrazy neuronów w jednej klatce/5 s przez okres 100 sekund kontrolowany przez oprogramowanie do akwizycji obrazu. Alternatywnie, rejestruj obrazy w krótszych odstępach czasu i przez dłuższy czas, na przykład z jedną klatką na 2 s w okresie 300 sekund.
   nuta: Dostępnych jest wiele aplikacji do wykonywania zdjęć sekwencyjnych, z których wiele byłoby odpowiednich dla tej metody. Dlatego nie zaleca się żadnej konkretnej aplikacji; Zamiast tego każdy badacz powinien korzystać z dowolnej dostępnej aplikacji.

2. Analiza obrazu

1. Otwórz wszystkie sekwencyjne obrazy w oprogramowaniu ImageJ z ręcznym śledzeniem.
   nuta: Do tej pory śledzenie ręczne było szeroko stosowane w eksperymentach śledzących. Śledzenie ręczne zostało opracowane przez dr Fabrice'a Cordelièresa. Szczegółowe instrukcje na piśmie są dostępne online. Na potrzeby analizy jakość danych obrazowych poprawia się dzięki wystarczającej liczbie obrazów. Zaleca się użycie więcej niż 20 obrazów.
2. Aby połączyć sekwencyjne obrazy, wybierz→ → . Klikać.
3. Wybierz → ; pojawi się okno śledzenia.
4. Kliknij pole wyboru i zdefiniuj parametry śledzenia w sekcji parametrów.
   nuta: Można ustawić kilka parametrów, w tym interwał czasowy, kalibrację x/y, kalibrację z, rozmiar kwadratu wyszukiwania do wyśrodkowania, rozmiar kropki, szerokość linii i rozmiar czcionki. W tym uproszczonym teście zdefiniowano zarówno przedział czasowy, jak i kalibrację x/y. W innych warunkach eksperymentalnych może być konieczne zdefiniowanie również innych parametrów. Stosowane tutaj parametry są następujące: wynosi 5 s, a wynosi 0,26642 μm dla soczewki obiektywowej 40X Plan Apo 0,95NA lub 0,10657 μm dla soczewki obiektywowej 100X Plan Apo VC NA1.4.
5. Po zdefiniowaniu parametrów kliknij na, aby rozpocząć nową ścieżkę.
6. Po określeniu interesujących pęcherzyków (np. pęcherzyków oznaczonych niebieskimi i czerwonymi grotami strzałek na rysunku 1A (prawy panel)), kliknij środek sygnałów na sekwencyjnych obrazach, aby zapisać współrzędne xy. Wyniki zarejestrowanych współrzędnych xy, odległości i prędkości pojawiają się w nowym oknie.
   nuta: W przypadku lizosomów w neuronach często obserwuje się duże jasne sygnały fluorescencyjne (np. Rysunek 1A (prawy panel), pomarańczowy grot strzałki). Sygnały te czasami wykazują nagromadzone pęcherzyki lub patologiczne żylaki, dlatego należy unikać tych sygnałów w celu ilościowego określenia ruchliwości.
7. Powtórz krok 2.6, aby zebrać współrzędne xy pęcherzyków ze wszystkich kolejnych obrazów; po wybraniu punktu odniesienia każdy obraz automatycznie przechodzi do kolejnego obrazu.
8. Wyeksportuj te dane do nowej tabeli (np. arkusza kalkulacyjnego). Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby utworzyć odpowiedni wykres (patrz tabela materiałów).
   nuta: Aby przeanalizować dane, wybierz kolumnę, zsumuj wszystkie wartości tej kolumny i pokaż odległość ruchliwości w postaci wykresu słupkowego, tak jak na rysunku 1B. Dodatkowo powtórz ten krok, oblicz średnią całkowitej odległości ruchliwości i pokaż jako wykres słupkowy, jak na rysunku 1C. Oprogramowanie do tworzenia wykresu słupkowego i danych falowych jest pokazane w tabeli materiałów.

Results

Rycina 1: Ruchliwość lizosomów w dendrytach neuronalnych. (A) Mysie neurony korowe (4 DIV) transfekowano plazmidem LAMP-EGFP przez 2 dni. Zdjęcie przedstawia ruchliwość pęcherzyków zawierających LAMP-EGFP w dendrytach. Wstawka przedstawia poklatkowy obraz pęcherzyków dodatnich LAMP-EGFP. Czerwony grot strzałki oznacza poruszający się pęcherzyk, a niebieski grot strzałki wskazuje pęcherzyk spoczynkow...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Podłoże nerwowo-podstawowe	Rybak termiczny	21103-049
Opti-MEM	Rybak termiczny	31985070	Pożywka wolna od surowicy
Penicilin Streptmycyna	Rybak termiczny	15140122
L-glutamina	Rybak termiczny	25030081
B-27 Suplementy	Rybak termiczny	17504044
bromowodorek poli-D-lizyny	Sigma	Zobacz materiał P7280
poli-L-ornityna	Sigma	Zobacz materiał P4957
Lipofektamina 2000	Rybak termiczny	11668027	Odczynnik do transfekcji
Polietylenomina "Max"	Politechniki	Numer katalogowy: 24765	Odczynnik do transfekcji. Jako alternatywę dla Lipofectamine2000 dostępne jest 0,1 mg / ml polietylenoiminy rozpuszczonej w sterylizowanej wodzie. Ale jest to niska wydajność i wysoka toksyczność.
BIOREVO BZ-9000	Klucz	nie
System inkubacji INUG2-K13	Hit Tokaju	nie
GraphPad Prism w wersji 6.0	Oprogramowanie GraphPad	nie
Excel w wersji 15	Firmy Microsoft	nie
ImageJ wersja 1.47	nie	nie