Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Immunofluorescencja
- Przygotować roztwory zawierające bufor blokujący, bufor przeciwciał, bufor płuczący 1 i bufor płuczący 2 (patrz Tabela 1).
- Raz opłucz plastry buforem fosforanowym (PB), aby usunąć nadmiar związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT).
- Usuń roztwór plastikową pipetą bez zasysania plasterków mózgu. Dodać 250 μl świeżego PB za pomocą pipety 1000 μL.
ostrożność: Plastry nie powinny wysychać, więc dobrze usuń i dodaj płyny.
- Usunąć PB za pomocą plastikowej pipety i dodać 250 μl buforu blokującego do studzienki za pomocą pipety 1000 μl. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce.
- W czasie inkubacji rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w buforze przeciwciał w probówce reakcyjnej. Użyć 250 μl buforu przeciwciał na studzienkę i dodać odpowiednią ilość przeciwciała (patrz Tabela 2), pipetując je bezpośrednio do roztworu za pomocą pipety o pojemności 2 μl. Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Wkrótce potem przemieszaj wir, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.
nuta: Aby określić fluorescencję tła, barwienie należy również wykonać bez dodawania przeciwciała pierwszorzędowego. W tym celu należy inkubować plasterek w roztworze przeciwciał bez przeciwciał pierwszorzędowych zgodnie z protokołem.
- Po czasie inkubacji usunąć bufor blokujący za pomocą plastikowej pipety i dodać 250 μl roztworu przeciwciała zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe do studzienki. Inkubować plastry z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.
- Następnego dnia umyj plastry buforem myjącym 1 3x przez 10 min w temperaturze RT na shakerze.
- Usunąć pożywkę plastikową pipetą i dodać 300 μl buforu myjącego 1 do dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórz 3 razy.
- Podczas etapów przemywania rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem w buforze przeciwciał w probówce reakcyjnej. Użyć 250 μl buforu przeciwciał na studzienkę i dodać odpowiednią ilość przeciwciała (patrz Tabela 2), pipetując je bezpośrednio do roztworu za pomocą pipety o pojemności 2 μl. Wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Wkrótce potem przemieszaj wir, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.
ostrożność: Ponieważ przeciwciała są wrażliwe na światło, wszystkie kroki od tego momentu muszą być wykonywane w ciemności.
- Po zakończeniu płukania należy usunąć bufor płuczący plastikową pipetą i dodać 250 μl roztworu przeciwciał zawierających przeciwciała drugorzędowe do studzienki drobnoustrojowej. Inkubować plastry z przeciwciałami drugorzędowymi przez 90 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Plastry myć buforem myjącym 2 3x przez 10 min w temperaturze RT.
- Podczas etapów płukania rozcieńczyć 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) w 0,1 M PB w stężeniu 1:2000.
- Usunąć bufor płuczący 2 plastikową pipetą i dodać 250 μl roztworu DAPI do studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
- Usunąć roztwór DAPI plastikową pipetą i dodać 500 μl 0,1 M PB na studzienkę za pomocą pipety 1000 μl.
- Zamontuj plastry na szkiełkach mikroskopowych.
- Umieść szkiełko mikroskopowe pod stereoskopem. Za pomocą cienkiego pędzelka nałóż na szkiełko trzy oddzielne krople po 0,1 mln PB. Umieść jedną plasterkę na kroplę na szkiełku mikroskopowym.
- Użyj cienkiego pędzelka, aby spłaszczyć i zorientować plastry na szkiełku mikroskopowym.
- Gdy wszystkie plastry zostaną prawidłowo ułożone, usuń nadmiar PB chusteczką i dokładnie wysusz szkiełko.
ostrożność: Unikaj całkowitego wysuszenia plastrów mózgu.
- Dodać 80 μl podłoża do zatapiania na szkiełku. Ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na szkiełko, osadzając w ten sposób plastry mózgu.
- Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w dygestoria na 1-2 godziny (przykryj je, aby uniknąć ekspozycji na światło) i przechowuj je w pojemniku na szkiełka mikroskopowe w temperaturze 4 °C.
nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
2. Obrazowanie
- Po całkowitym utwardzeniu podłoża zatapiającego umieścić szkiełko mikroskopowe pod mikroskopem konfokalnym.
nuta: Mikroskopia epifluorescencyjna w połączeniu z oprogramowaniem do dekonwolucji powinna dać podobną jakość obrazu.
- Dostosuj ustawienia lasera, zwiększając lub zmniejszając intensywność lasera dla każdego kanału, tak aby kilka pikseli było prześwietlonych i zapewniało maksymalny rozkład wartości szarości.
- Zdobądź wirtualne tkanki całego wycinka mózgu dla różnych kanałów.
- W oprogramowaniu do obrazowania wybierz opcję Kafelki i ręcznie nakreśl wycinek mózgu za pomocą konfiguracji regionu kafelków.
- Rozmieść punkty podparcia w całym regionie kafelka i dostosuj fokus dla różnych punktów podparcia, naciskając przycisk Sprawdź regiony/pozycje kafelków....
- Dostosuj ustawienia w trybie akwizycji zgodnie z żądaną rozdzielczością i rozmiarem pliku wynikowego obrazu, a następnie rozpocznij skanowanie.
- Po zakończeniu skanowania użyj funkcji Stitching, aby przetworzyć wirtualną tkankę. Wyeksportuj plik jako .tif za pomocą funkcji Eksport obrazu.
3. Analiza komputerowa
- Załaduj wszystkie pojedyncze kanały dla jednego obrazu do FIDŻI, klikając Plik| Otwarty.
- Za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego nakreśl jedną półkulę w kanale DAPI. Utwórz maskę zaznaczenia, klikając Edytuj| Wybór| Utwórz maskę.
- Określ średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów (Mover i synaptofizyna), klikając Analizuj| Środek.
nuta: Upewnij się, że wybrałeś różne kanały, aby określić średnie wartości intensywności fluorescencji dla każdego kanału.
- Skopiuj średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów do arkusza kalkulacyjnego.
- Określ średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów w obszarze zainteresowania, wyznaczając obszar również za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego. Użyj atlasu mózgu myszy jako odniesienia.
- Powtórz kroki 3.1-3.5 dla wszystkich półkul i wszystkich obszarów zainteresowania.
nuta: Określ wartości dla każdej półkuli osobno, aby później porównać wartości w obszarze zainteresowania z obszarem na półkuli (patrz krok 4.2).
4. Obsługa danych
- W przypadku, gdy fluorescencja tła jest wysoka, może być konieczne odjęcie tła. W tym celu należy określić średnią intensywność fluorescencji dla wycinka przetworzonego bez pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białku referencyjnemu (tutaj: synaptofizynie) i odjąć tę wartość od wszystkich wartości uzyskanych dla obszarów mózgu i półkul.
- Po ustaleniu średnich intensywności fluorescencji dla pojedynczych kanałów dla każdej półkuli i każdego obszaru zainteresowania (patrz Tabela 3), należy obliczyć stosunek Mover do synaptofizyny, dzieląc wartość Mover przez wartość dla synaptofizyny (żółty w Tabeli 3). Wykonaj tę czynność dla każdej półkuli i każdego obszaru zainteresowania osobno.
- Podziel stosunek uzyskany dla jednego obszaru zainteresowania przez współczynnik uzyskany dla odpowiedniej półkuli (kolor pomarańczowy w tabeli 3), aby określić stosunek obszaru zainteresowania do półkuli.
- Aby określić względną liczebność Movera, przelicz stosunek uzyskany w 4.2 na procent, określając jego odchylenie od 1 (kolor czerwony w tabeli 3). Współczynnik 1,25 dałby zatem względną liczebność Ruchu o 25% powyżej średniej, a współczynnik 0,75 dałby względną liczebność Ruchu o 25% poniżej średniej.
Tabela 1: Rozwiązania użyte w tym protokole.
| Utrwalacz (500mL) |
Wymieszaj 20g paraformaldehydu (całkowita stężenie: 4%)
50 ml 10 x PBS roztwór podstawowy (całkowita konk. 1x)
450 ml bidest H2OAdzmień pH do 7,4 z NaOH
Uwaga: Aby rozpuścić paraformaldehyd w PBS, podgrzej roztwór. Nie podgrzewać powyżej 70 oC, ponieważ PFA rozpada się w temperaturach wyższych niż 70 oC.
Uwaga: PFA jest toksyczny, potencjalnie rakotwórczy i teratogenny. Podczas pracy z PFA należy nosić rękawice i pracować pod wyciągiem. Unikaj połknięcia. |
| 0,1 mln PB (1L) |
Roztwór podstawowy X
35,61 g Na2HPO4,2H 2O w 1 L bidest H2O | Roztwór podstawowy Y
27,60 g NaH2PO 4,2H 2O w 1 L bidest H2O |
Wymieszaj 385 ml roztworu podstawowego X
115 ml roztworu podstawowego Y
500 ml bidest H2O |
| Bufor blokujący (50 mL) |
Wymieszaj 1,25 ml normalnej surowicy koziej (całkowita stężenie: 2,5%)
1,25 ml normalnej surowicy osła (całkowita skuteczność: 2,5%)
0,5 ml niejonowego środka powierzchniowo czynnego (Triton-X100, stężenie całkowite: 1%)
47 ml 0,1 mln PB |
| Bufor przeciwciał (50 ml) |
Wymieszaj 0,25 ml normalnej koziej surowicy (całkowita stężenie: 0,5%)
0,25 ml normalnej surowicy osła (stężenie całkowite: 0,5%)
0,1 ml niejonowego środka powierzchniowo czynnego (stężenie całkowite: 0,2%)
49,4 ml 0,1 mln PB |
| Bufor do mycia 1 (50 mL) |
Wymieszaj 1 ml normalnej surowicy koziej (całkowita stężenie: 2 %)
49 ml 0,1 mln PB |
| Bufor do mycia 2 (50 mL) |
Wymieszaj 0,5 ml normalnej surowicy koziej (całkowita stężenie: 1 %)
49,5 ml 0,1 mln PB |
Tabela 2: Przeciwciała użyte w tym protokole.
| Przeciwciała pierwszorzędowe |
| Skierowane przeciwko | Gatunki żywicielskie | RYD | koncentracja |
| Mover | królik | AB_10804285 | 1:1000 |
| Synaptofizyna | świnka morska | AB_1210382 | 1:1000 |
| Przeciwciała drugorzędowe |
| Docelowe gatunki zwierząt | Gatunki żywicielskie | Fluorofor | koncentracja |
| królik | osioł | AlexaFluor 647 | 1:1000 |
| świnka morska | koza | AlexaFluor 488 | 1:1000 |
Tabela 3: Przykład postępowania z danymi.
TGL
TGL
TGL
zł
| Półkula |
| Półkula # | Średnia intensywność fluorescencji Synaptofizyna (A.U.) | Średnia intensywność fluorescencji Mover (A.U.) | Stosunek Mover/Synaptophysin | | |
1
2
3
4
5
6 | 29.134
31.008
38.641
30.775
21.658
Z dnia 27 kwietnia 277 | 22.810
24.046
29.324
25.444
18.091
23 364 | =C3/B3 0,783
=C4/B4 0,775
=C5/B5 0,759
=C6/B6 0,827
=C7/B7 0,835
=C8/B8 0,857 | | |
| Hipokamp |
| Półkula # | Średnia intensywność fluorescencji Synaptofizyna (A.U.) | Średnia intensywność fluorescencji Mover (A.U.) | Stosunek Mover/Synaptophysin | Stosunek do półkuli | Względna liczebność przeprowadzek (%) |
1
2
3
4
5
6 | 35.26
33.955
41.231
39.853
30.129
28.737 | 29.889
27.825
31.978
31.787
27.817
Z dnia 25 861 | =C11/B11 0,848
=C12/B12 0,819
=C13/B13 0,776
=C14/B14 0,798
=C15/B15 0,923
=C16/B16 0,900 | =D11/D3 1,083
=D12/D4 1,057
=D13/D5 1,022
=D14/D6 0,965
=D15/D7 1,105
=D16/D8 1,051 | =(E11-1)*100 8.269
=(E12-1)*100 5.673
=(E13-1)*100 2.200
=(E14-1)*100 -3.528
=(E15-1)*100 10.530
=(E16-1)*100 5.064 |
