Artykuł metodologiczny

Ocena integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych mięśni grzbietowych podłużnych u Drosophila

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Sidisky, J. M., et al. Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłego Drosophila w związku z neurodegeneracją. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje protokół oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych w grzbietowych mięśniach podłużnych Drosophila. Procedura polega na barwieniu neuronów i mięśni dwoma odrębnymi przeciwciałami i porównaniu wzorców fluorescencji między muchami zmutowanymi i dzikimi. Zmniejszenie barwienia neuronów u zmutowanych much wskazuje na neurodegenerację, podczas gdy struktura mięśni pozostaje nienaruszona.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Błyskawiczne zamrażanie i bisekcja klatki piersiowej

  1. Przed rozpoczęciem bisekcji napełnij kolbę Dewara ciekłym azotem, zakładając odpowiednie rękawice krioochronne i okulary ochronne. Zaopatrz się w łamacz ostrzy, ostrza do piór, jedną parę drobnych kleszczy, lód, lodowaty 1x PBS i pęsetę kriogeniczną.
  2. Przygotuj wiaderko na lód, aby utrzymać 1x PBS lodowaty lód.
  3. Użyj łamacza ostrzy, aby chwycić ostrze pióra pod kątem i zegnij ostrze, aby odłamać mały kawałek. Łamacz ostrzy może następnie zablokować ostrze w pozycji, która może być używana jako mały skalpel.
    nuta: Jedno ostrze powinno wystarczyć na wszystkie grupy. Przełącz, jeśli ostrze pęknie lub stępi się.
  4. Dodaj czystą końcówkę pipety do P200 i wyjmij 1/5 końcówki, aby przetransportować próbki.
  5. Przygotuj nową probówkę do mikrowirówki dla każdej grupy i dodaj 200 μl 1x PBS do każdej probówki. Ta druga probówka zostanie użyta do zebrania końcowych preparatów DLM.
  6. Usuń wszystkie 1x PBS z probówek za pomocą pipety Pasteura.
  7. Zakładając odpowiedni sprzęt ochronny, zanurz rurkę w kolbie z ciekłym azotem na 10 s za pomocą pęsety kriogenicznej.
    nuta: Rurki powinny być szczelnie zamknięte, aby rurka nie eksplodowała.
  8. Wyjmij probówkę z ciekłego azotu i dodaj około 300 μl lodowatego 1x PBS do próbek za pomocą pipety Pasteura. Próbki należy przechowywać na lodzie.
  9. Dodaj lodowaty 1x PBS do 10-centymetrowego naczynia preparacyjnego pokrytego elastomerem silikonowym i dozuj pierwszą klatkę piersiową zmodyfikowaną pipetą o pojemności 200 μl.
  10. Umieść klatkę piersiową brzuszną stroną do góry. W jednej ręce użyj pary kleszczy, aby ustawić klatkę piersiową, aw drugiej użyj cienkiej pary kleszczy, aby usunąć część zwoju piersiowego, aby odsłonić linię środkową klatki piersiowej.
  11. Użyj linii środkowej klatki piersiowej jako prowadnicy, aby wykonać płytkie cięcie przez 1/3 klatki piersiowej za pomocą ostrza.
  12. Zdejmij ostrze z klatki piersiowej i ustaw klatkę piersiową pod kątem 45° za pomocą kleszczy. Włóż ponownie ostrze i przetnij prosto linię środkową klatki piersiowej. Spowoduje to powstanie dwóch półkrwi.
  13. Weź jeden hemitorax na raz i usuń nadmiar tkanki pod włóknem mięśniowym DLM F (ryc. 1B), najbardziej brzusznym włóknem. Użyj ostrza, aby ostrożnie wykonać jedno lub dwa cięcia, aby usunąć nadmiar tkanki bez uszkadzania DLM.
  14. Po odizolowaniu przenieś hemitoraks do właściwej probówki z 1x PBS.
  15. Powtarzaj kroki 1.6\u20121.14, aż zostanie wykonanych 10 wypreparowanych półraków w grupie.

2. Barwienie strukturalne

  1. Po przecięciu próbki klatki piersiowej należy umieścić tkankę w buforze blokującym (1x PBS z 0,1% normalną surowicą kozią i 0,2% Triton X-100 o pH 7,4), aby przeniknąć przez tkankę i zapobiec niespecyficznemu barwieniu. Użyj pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar 1x PBS i dodaj 1,5 ml buforu blokującego do każdej probówki. Blokować tkanki przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować próbki do barwienia strukturalnego przy użyciu fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała, peroksydazy chrzanowej 488 (anty-HRP-488) w rozcieńczeniu 1:200 i falloidyny-647 w rozcieńczeniu 1:1000 w buforze blokującym do barwienia neuronów ruchowych i tkanki mięśniowej, odpowiednio. Zrób tyle plamy, aby mieć 150 μl na probówkę. Przechowywać plamę w temperaturze 4 °C, przykrytą folią lub w ciemnym pudełku, aż będzie gotowa do barwienia.
  3. Po zablokowaniu usunąć nadmiar buforu blokującego za pomocą szklanej pipety Pasteura.
  4. Przed dozowaniem bejcy strukturalnej należy ją wymieszać. Dodaj 150 μl plamy do każdej tubki. Umieścić próbki w ciemnym pudełku na rotatorze w temperaturze pokojowej na 2 godziny.
  5. Usuń plamę i umyj chusteczki cztery razy w 1,5 ml o temperaturze pokojowej 1x PBS z 0,3% Triton X-100 przez 5 minut na rotatorze w ciemnym pudełku. Próbki są teraz gotowe do zamontowania na szkiełku.

3. Tkanka montażowa

  1. Po umyciu próbek w PBST należy przygotować szkiełko mikroskopowe w celu zamontowania tkanki do barwienia. Przygotuj dodatkowe materiały, w tym szklane szkiełka nakrywkowe, pipetę P200, końcówki do pipet 200 μl, nożyczki, przezroczyste wzmocnienia, kleszczyki o prostych krawędziach, fluorescencyjne media montażowe zapobiegające blaknięciu, lakier do paznokci i ciemne pudełko do zakrycia szkiełek.
  2. Oznacz szkiełko, aby zidentyfikować próbki i wyczyść je chusteczkami Kim, aby usunąć wszelkie smugi.
  3. Aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe nie uszkodzi próbek hemithorax należy zbudować "most" za pomocą etykiet wzmacniających. Przeciąć jedną etykietę wzmacniającą na pół i umieścić każdą połówkę w odległości około 15 mm od siebie. Odległość ta musi być mniejsza niż szerokość szkiełka nakrywkowego. Powtórz ten krok cztery razy, aby ukończyć "most" o wysokości 5 etykiet.
  4. Weź pipetę P200 i zmodyfikuj końcówkę, odcinając 1/5 końcówki, aby przenieść próbki do szkiełka. Próbki należy przenieść na szkiełko znajdujące się pośrodku mostu.
  5. Weź krawędź chusteczki laboratoryjnej i usuń nadmiar PBST. Za pomocą kleszczy ułóż DLM tak, aby wszystkie próbki były skierowane mięśniowo do góry, a naskórek do dołu.
  6. Za pomocą standardowej końcówki do pipet P200 nanieś 70 μl podłoża montażowego na szkiełko, unikając pęcherzyków powietrza. Dozuj media w okrągły wzór wewnątrz wzmocnień, zaczynając od zewnątrz do środka.
  7. Umieść szkiełko nakrywkowe na wzmocnieniach.
  8. Użyj lakieru do paznokci, aby pokryć zewnętrzne krawędzie na obwodzie szkiełka nakrywkowego. Nakładaj obficie, aby uzyskać całkowite uszczelnienie tkanki.
  9. Umieść szkiełko na płaskiej powierzchni w ciemności, pozostawiając co najmniej 10 minut do wyschnięcia i zapobiegając fotowybielaniu lub utracie fluorescencji. Preparaty mogą być teraz natychmiast używane do obrazowania lub w inny sposób przechowywane w folderze slajdów w temperaturze -20 °C w celu późniejszego przeglądania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1: Postępująca denerwacja synaps DLM w modelu Drosophila ALS. (A) Na schemacie pokazano pokolenie transgenicznych muszek ALS wykazujących ekspresję ludzkiej zmutowanej formy białka wiążącego smołę o sile 43 kDa (TDP-43). (B) Ilustracja przedstawia kształt i orientację półkuli u dorosłego Drosophila. Korzystając z protokołu, możemy zaobserwo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
32% FormaldehydNauki o mikroskopii elektronowejNumer katalogowy: 15714Konserwacja tkanek
Ławka RockerGenesee Scientific31-302Obracanie próbek podczas barwienia
Łamacz ostrzyNarzędzia naukoweNumer katalogowy 10053-09Służy do trzymania ostrza z piór
szkiełka nakrywkoweFisher NaukowyNumer katalogowy: 12548ADo montażu chusteczki
rękawice kriogeniczneFirma VWR97008-198chronić ręce przed ciekłym azotem
pęseta kriogenicznaFirma VWRNumer katalogowy: 82027-432Trzymaj probówkę o pojemności 2,0 ml w ciekłym azocie
Kolba Dewara-1900 mlThomas NaukowyNumer katalogowy: 5028M54Utrzymuj ciekły azot
Ostrza z piórNauki o mikroskopii elektronowej72002-01Ostrza skalpela
Grzywna Forecps x 2Narzędzia naukoweNumer katalogowy: 11252-20Jedna dobra para do oczyszczania linii środkowej klatki piersiowej. Drugą parę można stępić za pomocą kamienia do ostrzenia.
Anty HRP sprzężony z FITCLaboratoria Jacksona123-545-021Plami neurony ruchowe. Stosowany w stężeniu 1:100
zamrażarka ()Fisher Naukowy14100FChroni próbki przed światłem
szklane pipety PasteuraFirma VWRNumer katalogowy: 14637-010Służy do przenoszenia próbek
Szkiełka szklaneFisher Naukowy12550143Do montażu chusteczki
Nośniki montażowe (Vectashield) Anti-BlakneFirma VWRNumer katalogowy: 101098-042Media montażowe zachowują sygnalizację fluorescencyjną
lakier do paznokciNauki o mikroskopii elektronowejNumer telefonu 72180Uszczelki do szkiełek mikroskopowych
normalna kozia surowicaFisher NaukowyPCN5000Zapobiega nieswoistemu wiązaniu przeciwciał
PędzlemGenesee Scientific59-204 Rozdział 19-204Przenoszenie much
PbsFisher Naukowy10-010-023Roztwór soli fizjologicznej do preparowania i barwienia
Falloidyna 647Księga AbcamAB176759Barwi F-aktynę w tkance mięśniowej. Stosowany w stężeniu 1:1000
Plastikowa szalka Petriego (100 mm)Firma VWRNumer katalogowy: 25373-100Naczynie rozwarstwiające
Etykiety zbrojeniaW.B. MasonAVE05722Zapewnia podparcie dla szklanego szkiełka nakrywkowego na zamontowanej chusteczce
Blok do ostrzeniaGrainger1RDF5Utrzymywanie ostrych cienkich kleszczy, a także tępienie oddzielnej pary
Teczka slajdówFirma VWRNumer katalogowy: 10126-326Przechowywanie próbek
Standardowe nożyczki biuroweW.B. MasonACM40618Cięcie etykiet zbrojeniowych
ul. Sylgard 184Nauki o mikroskopii elektronowejNumer katalogowy: 24236-10Powłoka do naczynia rozwarstwiającego
Tryton-X-100Nauki o mikroskopii elektronowejNumer katalogowy: 22140Pomaga w przepuszczalności tkanek
Vannas Disssection SissorsNarzędzia naukowe1500-00Służy do usuwania odnóży muchowych i wykonywania nacięcia na klatce piersiowej
SZT. higienicznej higienicznej powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drosophila Neuromuscular JunctionFluorescence StainingAntibody LabelingTissue BisectionMicroscopy VisualizationNeurodegeneration AssessmentMuscle Structure IntegrityMutant Protein ExpressionWild type Comparison

Powiązane artykuły