Badanie uszkodzenia mózgu u larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Streszczenie

Źródło: Kuipers, J. et al., Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomia) zdrowego i uszkodzonego mózgu danio pręgowanego.J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje metodę badania uszkodzeń mózgu larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM), techniki, która łączy elementy zarówno skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), jak i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości. Przedstawiono w nim etapy związane z przygotowaniem próbek i pozyskiwaniem obrazów STEM o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji uszkodzenia mózgu.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Utrwalanie i osadzanie
   1. Utrwalenie
      1. Znieczulić larwy ryb w wodzie danio pręgowanego (0,003%) dodane do E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO_4, 10 mM HEPES, pH 7,6) i przetestować głębokość znieczulenia, delikatnie szturchając końcówką pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem preparacyjnym, aż ruch przestanie być wykrywany (ryc. 1A).
      2. Podczas przetwarzania próbek do korelacyjnej mikroskopii elektronowej (EM) po uzyskaniu danych z obrazowania in vivo za pomocą obrazowania konfokalnego lub 2 fotonów w 1,8% agarozie, jak opisano, utrwal larwy w agarozie za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) zawierającej Triton-X-100 (0,05%).
      3. Wytnij larwy z agarozy i przetwórz na dużą skalę EM.
      4. Utrwal larwy w świeżym 4% paraformaldehydzie w PBS zawierającym Triton-X-100 (0,05%) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w plastikowych probówkach.
         nuta: Komórki wyhodowane w hodowli (in vitro) mogą być bezpośrednio utrwalone w aldehydzie glutarowym, jak opisano w następnym kroku (1.1.1.5).
      5. Usunąć roztwór i dodać 100 μl 0,5% PFA, 2% aldehydu glutarowego (GA) i 0,1 M kakodylanu sodu (pH 7,4). Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Próbki należy dwukrotnie płukać w 0,1 M kakodylanu sodu.
      6. Wytnij głowy larw rostralnie do tyłomózgowia, aby ułatwić penetrację osmu. Używaj cienkich strzykawek/kleszczyków.
      7. Larwy postfiksu w 1% tetratlenku osmu (OsO₄)/1,5% żelazocyjanku potasu (K₄[Fe(CN)₆]) w 0,1 M kakodylanu sodu na lodzie przez 2 godziny i płukać 3 x 5 min w podwójnie destylowanym_H2O.
      8. Odwodnić w etanolu przez 20 minut inkubacji w rosnących stężeniach etanolu (50%, 70%, 3 razy 100%).
   2. Osadzanie
      1. Przygotuj żywicę epoksydową zgodnie ze standardowymi recepturami stosowanymi w EM labs.
         nuta: Żywicy epoksydowej używamy w następujący sposób: zmieszać 19,8 g eteru glicydowego 100, 9,6 g bezwodnika kwasu 2-dodecenylobursztynowego i 11,4 g bezwodnika metylonadynowego za pomocą mieszadła magnetycznego. Dodać 0,5 g DMP-30 (tris-(dimetyloaminometylo)fenol) i ponownie wymieszać.
      2. Wysiadywać larwy przez noc w 50% żywicy epoksydowej w etanolu (v/v) podczas obracania (RT).
      3. Zastąp rozcieńczoną żywicę epoksydową czystą żywicą. Inkubować przez 30 minut, ponownie dodać świeżą żywicę i inkubować przez kolejne 30 minut. Ponownie odświeżyć żywicę, a następnie inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, następnie przez 15 minut w temperaturze 58 °C i przez kolejną 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod niskim ciśnieniem (200 mbar).
      4. Ustaw głowice w dostępnych na rynku silikonowych płaskich formach do zatapiania pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą igły lub wykałaczki z przodem skierowanym w stronę formy lub w razie potrzeby (Rysunek 1B).
      5. Polimeryzować żywicę epoksydową przez noc w temperaturze 58 °C. Jeśli żywica epoksydowa jest nadal zbyt miękka, odczekaj kolejny dzień na polimeryzację i stwardnienie w temperaturze 58 °C. Zbadaj sztywność, wywierając nacisk za pomocą kleszczy. Jeśli to łatwo pozostawia wgłębienie, odczekaj kolejny dzień na polimeryzację i stwardnienie w temperaturze 58 °C. Gdy próbka jest w pełni stwardniała, przystąp do przycinania i krojenia.
      6. Odetnij nadmiar żywicy z króćca za pomocą żyletek (Rysunek 1B).
2. Podział na sekcje, kontrasty i montaż
   1. Cięcia
      1. Przeciąć blok żywicy epoksydowej za pomocą ultramikrotomu.
      2. Użyj noża do szkła lub diamentowego noża do histonoża, aby wyciąć półcienkie odcinki (500 nm) w celu barwienia błękitem toluidynowym/zasadową fuksyną (ryc. 1D), aby wykryć właściwe położenie.
      3. Przenieś półcienkie odcinki na szkiełkach mikroskopowych, podnosząc je szklaną pipetą Pasteura, której końcówka została zamknięta przez stopienie w płomieniu. Suszyć na gorącej płycie, aż nie pozostanie woda. Barwieć przez 10 sekund 1% błękitem toluidynowym w wodzie na gorącej płycie, a po spłukaniu wodą barwić przez 10 sekund 0,05% zasadowej fuksyny w 1% tetraboranie sodu. Zbadaj za pomocą normalnego mikroskopu świetlnego przy 10X do 40X.
      4. Po osiągnięciu właściwego miejsca/orientacji w mózgu, kontynuuj cięcie bloku żywicy epoksydowej nożem diamentowym, aby wyciąć ultracienkie odcinki (~ 70 nm; Rysunek 1E)
      5. Używaj łatwych do zidentyfikowania struktur anatomicznych w mózgu i wokół niego, w tym wgłębień węchowych, oczu i granic istoty szarej i białej, aby zidentyfikować obszar zainteresowania podczas ultracienkiego przekroju i dostosować kąt cięcia, gdy próbka jest pochylona.
      6. Zamontuj sekcję na miedzianych kratkach L2 x 1 z pojedynczym gniazdem (Rysunek 1F), aby umożliwić akwizycję bez przerywania przez pręty siatki. Użyj siatek powlekanych Formvar do podparcia sekcji.
   2. Kontrastujące
      1. Barwienie ultracienkich skrawków na siatkach przez 2 minuty w 2% octanie uranylu w metanolu, a następnie cytrynianu ołowiu Reynoldsa przez kolejne 2 minuty.

2. Akwizycja obrazu

1. Skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa na dużą skalę (STEM)
   nuta: Używamy skanowania EM z zewnętrznym generatorem skanowania, który jest w stanie uzyskać wiele dużych pól widzenia w wysokiej rozdzielczości przy użyciu wykrywania STEM. Zazwyczaj jeden obraz wygenerowany w ten sposób odpowiada polom widzenia ~ 100 obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM), co znacznie zmniejsza ilość ściegów.
   1. Montaż próbki w mikroskopie
      1. Umieścić siatkę z sekcją w uchwycie na próbkę z wieloma siatkami i przenieść do komory SEM.
   2. Ustawienie detektora STEM
      1. Umieść siatkę z próbką pod belką i przesuń ją w górę tak, aby znajdowała się ok. 5 mm od bieguna soczewki. Uzyskaj obraz przy napięciu 20 kV za pomocą detektora w obiektywie.
      2. Skoncentruj się na krawędzi siatki i dostosuj odległość roboczą do 4,0 mm.
      3. Przesuń uchwyt próbki do bezpiecznej pozycji i włóż detektor STEM.
      4. Wyśrodkuj otwór detektora STEM w polu obrazu, obracając regulacyjne podczas obrazowania z maksymalną prędkością za pomocą detektora w obiektywie.
      5. Ostrożnie przynieś uchwyt na próbkę, który będzie pasował między słupek obiektywu a detektor.
      6. Uzyskaj obraz za pomocą detektora w obiektywie, aby upewnić się, że znajduje się on w obszarze przekroju.
      7. Przełącz się na wykrywanie STEM (średni zysk i wszystkie ćwiartki ustawione na "minus"), uzyskaj obraz i wybierz obszar do skanowania.
      8. Podnieś napięcie przyspieszenia do 21 kV i poczekaj na ustabilizowanie się wiązki (znowu stabilny obraz), a następnie przejdź do 29 kV w krokach co 2 kV.
   3. Pozyskiwanie obrazów
      1. Wstępnie naświetlić próbkę (aby zapobiec zmianom jasności spowodowanym przez wiązkę elektromagnetyczną), pomniejszając tak, aby cały obszar do skanowania pasował do okna obrazu.
      2. Zmień przysłonę na 120 μm (aby zachować odpowiedni zakres dynamiki, wzmocnienia detektora muszą być zmniejszone o jeden stopień).
      3. Rozmycie powoduje, że obraz jest rozmyty.
      4. Spraw, aby skanowany obszar był jak najciaśniejszy, korzystając z opcji skanowania zredukowanego obszaru.
      5. Ustaw szybkość skanowania tak, aby klatka była skanowana w czasie ok. 1 - 2 sek.
         nuta: W zależności od rozmiaru i tkanki trwa to zwykle od 1/2 godziny (pole widzenia 100 x 100 μm (FOV)) do 3 godzin (1 000 x 500 μm).
      6. Powiększ co najmniej 100x i zeskanuj mały obszar przez 10 sek.
         nuta: Gdy obszar ten nie zmienia jasności w porównaniu z otoczeniem, wystarczające jest naświetlanie wstępne.
      7. Przywróć aperturę 30 μm (i wzmocnienie STEM na średnim)
      8. Skoncentruj się na próbce.
      9. Wyrównaj przysłonę za pomocą woblera (przy powiększeniu ~ 40 000X).
      10. W trybie ustawiania ostrości wybierz najjaśniejszy obszar/funkcję i ustaw szybkość skanowania tak, aby szczegóły były widoczne.
      11. W oprogramowaniu mikroskopu dostosuj jasność i kontrast, uważnie obserwując histogram, aby wszystkie piksele pozostały w zakresie dynamicznym. Zrób to samo dla najciemniejszego obszaru/obiektów.
      12. Wróć do jasnego obszaru i sprawdź ponownie. Bądź po bezpiecznej stronie, aby po obu stronach histogramu było trochę miejsca.
      13. Pomniejsz obraz, aby cały obszar do skanowania zmieścił się w oknie obrazowania i uruchom program akwizycji dużego obszaru.
      14. Użyj opcji kreatora, aby skonfigurować mozaikę, wybierając obszar z ekranu. Użyj rozmiaru piksela 2 - 5 nm w zależności od tego, jakie szczegóły są niezbędne. Użyj czasu przebywania 3 μs dla STEM.
      15. Wybierz opcję "autofokus na poprzednim kafelku", użyj oprogramowania do akwizycji na dużą skalę autofocus z domyślnymi ustawieniami firmy, zaznacz pole "sprawdź ustawienie przed wykonaniem" i określ, gdzie zapisać dane.
      16. Naciśnij "optymalizuj", aby sprawdzić ustawienia mikroskopu.
          nuta: Teraz zostanie pokazany potrzebny czas. Może to trwać do 72 godzin w przypadku obszarów o wymiarach 1 x 0,5 mm.
      17. W oknie wpisz "maksymalna rozdzielczość kafelka" 20 000, aby poszczególne kafelki nie były większe niż 20k x 20k, zapobiegając efektom krawędzi. Naciśnij "wykonaj".
      18. Gdy zostaniesz poproszony o sprawdzenie ostrości i jasności/kontrastu (B/C), wyłącz zewnętrzny generator skanowania i ostrożnie dostosuj ostrość i astygmatyzm w oprogramowaniu mikroskopu. Nie zmieniaj B/C.
          nuta: Stolik można przesuwać i zmieniać powiększenie, ale powiększenie musi być ustawione z powrotem na żądany rozmiar piksela.
      19. Ponownie włącz zewnętrzny generator skanowania i naciśnij "kontynuuj".

Wyniki

Rysunek 1: Przebieg pracy wielkoskalowej mikroskopii elektronowej tkanek na mózgach danio pręgowanego. oraz7-dniowe larwy danio pręgowanego. (B) Głowy larw danio pręgowanego zanurzone obok siebie w żywicy epoksydowej. (C) Nóż szklany do półcienkiego krojenia i orientowania próbki. (D) Reprezentatywny półcienki przekrój zabarwiony na niebiesko tolui...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
chemikalia
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Firma VWR	444152G
Trikaina	Sigma	E10521
Tryton- X-100	Sigma	Silnik X100
aldehyd glutarowy	Nauki polilogiczne	Rok 1909
Kakodylan sodu	Sigma	Zobacz materiał C0250
tlenek osmu	Nauki o mikroskopii elektronowej	Rok 19114
żelazocyjanek potasu (K4[Fe(CN)]6)	Merck	Numer katalogowy: 4984
etanol	Firma VWR	Numer katalogowy 20821.365
Octan uranylu	Merck	8473
Tetraboran sodu	Merck	1063808
Tolduidene niebieski	Merck	1273
Podstawowa Fuksina	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	340324
Cytrynian ołowiu	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	Przerwać
EPON (Urząd Ochrony T
Bezwodnik kwasu 2-dodecenylbursztynowego	Serva	Numer katalogowy: 20755
bezwodnik metylonadowy	Serva	Numer katalogowy: 29452
eter glicydowy 100	Serva	Numer katalogowy: 21045
Zobacz materiał DMP-30	Nauki polilogiczne	Okręg wyborczy 553
Standardowa płaska forma do osadzania	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer katalogowy 70901
nóż diamentowy	Diatome Inc.
Siatki miedziane	Nauki o mikroskopii elektronowej
dwustronna taśma węglowa	Nauki o mikroskopii elektronowej
Skanowanie EM Zeiss Supra55	Zeiss
ultramikrotom Leica EM UC7	Księga Leica
Zewnętrzny generator skanowania Atlas	Zasady fibicyjne

powiedział: SZT. SZT. TGL