Artykuł metodologiczny

Różnicowanie i dojrzewanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do organoidów nerwowych

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Cosset, E., et al. Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie pokazany jest krok po kroku protokół przekształcania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w organoidy nerwowe. Metoda polega na indukowaniu tworzenia rozety neuronalnej, a następnie kontrolowanej dojrzałości i końcowej hodowli na błonie hydrofobowej w celu uzyskania w pełni rozwiniętych organoidów nerwowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Utrzymanie i hodowla niezróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC)

  1. Przeprowadzaj konserwację i ekspansję hSEC w warunkach bezkarmowych poprzez wstępne powlekanie naczyń określoną macierzą zewnątrzkomórkową.
    1. Rozmrozić 300 μl macierzy zewnątrzkomórkowej w temperaturze 4 °C (typowe stężenie w zakresie 18-22 mg / ml, przechowywać na lodzie) i delikatnie wymieszać z 15 ml zimnego podłoża DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), aby uniknąć przedwczesnego żelowania macierzy zewnątrzkomórkowej. Dodać 7,5 ml macierzy zewnątrzkomórkowej do obu kolb T150.
    2. Inkubować szalki pokryte macierzą zewnątrzkomórkową w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę (maksymalnie przez noc).
    3. Usunąć pożywkę i zasiewy hESC do gęstości 6,5 x 104 komórek/cm2.
  2. Utrzymanie H1 (linia komórkowa hESC) w pożywce hESC i 1% penicylina/streptomycyna.
  3. Przepuścić komórki za pomocą procedury enzymatycznej: dodać 7,5 ml roztworu enzymatycznego do kolby T75 cm2 przez okres 1-2 minut w temperaturze 37 °C. Po całkowitym odłączeniu komórek dodaj 7,5 ml DMEM-F12, a następnie wiruj przez 5 minut przy 300 x g. Aby umożliwić lepsze przeżycie, ponownie umieść komórki w pożądanej gęstości na szalkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, w tym samym podłożu zawierającym inhibitor kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) (10 μM) przez 24 godziny.

2. organoidy nerwowe pochodzące z hESC

  1. Na 24 godziny przed rozpoczęciem hodowli 3D należy zastąpić pożywkę hESC pożywką bez surowicy uzupełnioną 10 μM inhibitorem ROCK (oba składniki są niezbędne do wspomagania przeżycia komórek i spontanicznego tworzenia neurosfery podczas fazy agregacji w płytce mikrostudzienki). Komórki powinny znajdować się w 60% zbieżności. Następnego dnia (dzień 0) należy odłączyć kolonie hESC jako pojedyncze komórki: usunąć pożywkę, przepłukać PBS bez Ca2+/Mg2+, dodać 5 ml enzymatycznego roztworu do rozpuszczania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty.
  2. Zebrać komórki w pożywce bez surowicy uzupełnionej 10 μM inhibitora ROCK i odwirować je przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i policzyć komórki w 10 ml pożywki bez surowicy uzupełnionej 10 μM inhibitora ROCK.
  3. Równolegle przepłukać płytkę mikrodołkową 2 ml pożywki bez surowicy na dołek i odwirować płytkę o sile 1200 x g przez 5 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki, co może zapobiec tworzeniu się neurosfery.
  4. Przygotować 28,2 x 106 komórek w 12,5 ml pożywki bez surowicy uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK. Dozować 1000 komórek/mikrostudzienkę. Odwirować komórki o sile 300 x g przez 5 minut i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc (maksymalnie 36 godzin). Na przykład, aby uzyskać 30 ludzkich organoidów neuronalnych, użyj jednej kolby T150 przy 70%-80% konfluencji (około 30 milionów komórek).
  5. Następnego dnia (dzień 1) zbierz kulki (za pomocą P1000) i umieść je na płytce 6-dołkowej. Do każdej studzienki dodaj 2 ml pożywki B27 i pożywki DMEM-F12 GlutaMAX i Neurobasel (wymieszać w stosunku 1:1), uzupełnionych 1% suplementami B27 i 1% aminokwasami endogennymi (NEAA). Aby promować szybką indukcję neuronalną, uzupełnij pożywkę podwójnym koktajlem hamującym SMAD (Sma i Mad Related Protein) składającym się z 10 μM TGFβ (transformujący czynnik wzrostu-beta) / aktywiny / inhibitora węzłowego i 0,5 μM inhibitora morfogennego białka kostnego (BMP). Od tego kroku naprzód kule są hodowane w ruchu obrotowym (60 obr./min, wytrząsarka orbitalna). Obrót ma kluczowe znaczenie, aby kule nie sklejały się ze sobą lub z płytą.
  6. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni: zegnij płytkę i pozwól kulkom opaść na 5 minut, usuń połowę pożywki (2 ml) i dodaj 2 ml świeżej pożywki B27 uzupełnionej czynnikami wzrostu i inhibitorami. Nie odwirowywać kulek.
  7. Wykonaj indukcję neuronalną zgodnie z następującym przebiegiem czasowym:
    1. Od 1 do 4 dni hodować kulki w pożywce B27 uzupełnionej podwójnym SMAD. Podwójny koktajl hamujący SMAD (10 μM TGFβ/Activina/inhibitor węzłowy i 0,5 μM inhibitor BMP) wspomaga indukcję neuronalną.
    2. Od 4 do 11 dni promuj proliferację rozet nerwowych pochodzących z hESC (do kulek), dodając 10 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 10 ng / ml podstawowego czynnika fibroblastów (bFGF) do pożywki B27 uzupełnionej podwójnym koktajlem SMAD.
      nuta: W dniu 11 większość komórek powinna być dodatnia na obecność Nestin.
    3. Od 11 do 13 dni hodować kulki w pożywce B27 uzupełnionej 0,5 μM inhibitorem BMP.
    4. Od 13 do 21 dni hoduj kulki w pożywce B27 uzupełnionej 10 ng / ml neurotroficznym czynnikiem glejowym (GDNF), 10 ng / ml neurotroficznym czynnikiem pochodzenia mózgowego (BDNF) i 1 μM inhibitora γ-sekretazy. GDNF i BDNF promują różnicowanie neuronów i gleju. Inhibitor γ-sekretazy pozwala na większe dojrzewanie neuronów.
    5. W dniu 21 umieść kulki (około 1000 kulek) na hydrofilowej membranie z politetrafluoroetylenu (PTFE) (średnica 6 mm, 0,4 μm) osadzonej na wkładce do płytki hodowlanej przeznaczonej dla płytek 6-dołkowych. Zatrzymaj obrót od tego kroku. Obecność rozet, obserwowana pod mikroskopem jasnego pola, wskazuje na inicjację różnicowania neuronalnego. Rozety nerwowe można zaobserwować 2-3 dni po poszyciu kulek na membranie PTFE.
    6. Dodawać 1 ml pożywki B27 uzupełnionej czynnikami wzrostu i inhibitorami (zgodnie z opisem) do każdej studzienki pod wkładką membranową, co 2-3 dni (zwykle w poniedziałek, środę i piątek), przez kolejne 3 tygodnie różnicowania.
    7. Od 21 do 25 dni hoduj ludzkie organoidy nerwowe w tym samym pożywce do dojrzewania nerwowego.
    8. Od 25 do 28 dni tylko pożywkę B27 uzupełniać 1 μM inhibitorem γ-sekretazy.
    9. Od 28 do 39 dni należy przerwać dodawanie inhibitora γ-sekretazy i kontynuować hodowlę ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie w pożywce B27.
      nuta: Po 3 tygodniach organoidy nerwowe są gotowe do użycia do implantacji GIC. Wraz z dojrzewaniem neuronalnym obserwowano zmniejszenie markera niedojrzałości nerwowej Nestin i wzrost dojrzałych markerów nerwowych β3-tubuliny i GFAP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 6-dołkowa (płytka 6-dołkowa)Sokół / Corning07-201-588
Aggrewell 400 (płytki do hodowli mikrostudzienek)Technologie komórek macierzystychNumer katalogowy: 34421
B27 suplementy (B27)Technologie życiowe / Invitrogen1238Dla obu protokołów, roztwór podstawowy 100x, roztwór końcowy 1x
Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)Wskazówki dotyczące komórekZobacz materiał GFH1-2Dla obu protokołów, roztwór podstawowy 100 μg/ml w czystym H2O, roztwór końcowy 20 ng/ml
Związek E a inhibitor γ-sekretazy (inhibitor γ-sekretazy)Calbiochem (Elektrownia Jądrowa)CAS 209986-17-4Dla obu protokołów (inhibitor gamma-sekretazy XXI), roztwór podstawowy 5 mM w DMSO, roztwór końcowy 1 μM
Czysty dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichZobacz materiał C6164Związki rozpuszczalnikowe, gotowe do użycia
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle (DMEM)Technologie życioweNumer katalogowy: 12491-015Do hodowli komórkowych, gotowy do użycia
Zmodyfikowana mieszanka Eagle Medium F-12 firmy Dulbecco (DMEM-F12)Gibco (firma Gibco)11320033Do hodowli komórkowych, gotowy do użycia
EDTA 0,1 mM (EDTA)Technologie życioweZobacz materiał AM9912Do hodowli komórkowych, gotowy do użycia
Czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF)Wskazówki dotyczące komórekZobacz materiał GFH2-2Dla obu protokołów, roztwór podstawowy 100 μg/ml w czystym H2O, roztwór końcowy 20 ng/ml
Hydrofilowa membrana politetrafluoroetylenowa (membrana PTFE)Interfejs BioCellPrzerwać
LDN-193189 (inhibitor BMP)Axon Medchem /Stemgen04-0072-02 /1509Dual/Smad, roztwór podstawowy 5 mM w DMSO, roztwór końcowy 0,5 μM
L-glutamina (L-glutamina)Gibco (firma Gibco)25030081L-glutamina (200 mM), roztwór podstawowy 200 mM, roztwór końcowy 2 mM
Matrigel (macierz zewnątrzkomórkowa)BD Nauki biologiczne354277Matryca z kwalifikacją hESC, roztwór podstawowy 18-22 mg/ml, roztwór końcowy 180-220 μg/ml
Millicell-CM Wkładka do płytki hodowlanej (0,4 μm) (Wkładka do płytki hodowlanej)MiliporyPICM03050
Przeciwciało monoklonalne anty-β-tubuliny IIISigmaZobacz materiał T8660Rozcieńczenie 1:1000
Wytrząsarka orbitalna MS, MS-NOR-30 (Wytrząsarka orbitalna)Kierunek naukiPrzekaźnik MS-NRC-30
Neuropodstawowy (Neurobazalny)Technologie życiowe / Gibco21103049Utrzymanie i dojrzewanie embrionalnych populacji komórek neuronalnych, gotowych do użycia
Aminokwasy endogenne (NEAA)Gibco (firma Gibco)Numer katalogowy: 11140Aminokwasy endogenne 100X, roztwór podstawowy 100x, roztwór końcowy 1x
Przeciwciało Nurr1 (M-196)Santa CruzSC-5568 (wersja angielska)Rozcieńczenie 1:100
Nutristem (pożywka z hESC)Przemysł biologiczny05-100-1APożywka z komórek macierzystych, gotowa do użycia
Penicilin / Streptomycyna (Penicilina / Streptomycyna )Technologie życiowe / Gibco15140122Do hodowli komórkowych roztwór podstawowy 5 mg/ml, roztwór końcowy 50 μg/ml
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+/Mg2+ (PBS bez Ca2+/Mg2+ )Technologie życiowe14190250Do hodowli komórkowych, gotowy do użycia
Kinaza Y-27632 związana z rho (ROCK)Abcam BiochemikaliaAB120129-1Inhibitor skał, roztwór podstawowy 50 mM w DMSO, roztwór końcowy 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activina/Inhibitor węzłowy)wzniesienieAsc- 163Dual-Smad, roztwór podstawowy 50 mM w DMSO, roztwór końcowy 10 μM
StemPro Accutase (roztwór enzymatyczny hESC)Gibco (firma Gibco)A11105-01Roztwór enzymatyczny hESC, gotowy do użycia
Kolba T150 (kolba T150)sokół08-772-1F
Transformujące czynniki wzrostu beta 3 (TGFβ3)Wskazówki dotyczące komórekGFH109-2Dla protokołu dopaminergicznego, roztwór podstawowy 100 μg/ml w czystym etanolu, roztwór końcowy 1 ng/ml
Trypsyna 0,25% (roztwór enzymatyczny)Technologie życiowe15050065roztwór enzymatyczny, gotowy do użycia
X-vivo (pożywka wolna od surowicy)LonzaBE04-743QSerum Free Medium, gotowe dla Ciebie
SZT. powiedział: powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie rozetek neuralnychpodw jna inhibicja SMADhodowla na membranie hydrofobowejinterfejs powietrze cieczmedium bogate w czynniki wzrostumedium do dojrzewania bogate w inhibitoryindukcja progenitor w neuralnychr nicowanie kom rek glejowych

Powiązane artykuły