Wytwarzanie dopaminergicznych organoidów neuronalnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Streszczenie

Źródło: Cosset, E. et al. Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w neurony dopaminergiczne, aby dostarczyć modelu do badania choroby Parkinsona. HESC są hodowane w pożywce do indukcji neuronalnej na płytce mikrodołkowej w celu utworzenia neurosfer 3D. Są one następnie hodowane w pożywce do indukcji neuronalnej, aby promować różnicowanie w dopaminergiczne neurony progenitorowe. Końcowe dojrzewanie neuronów zachodzi we wstawce hodowlanej w warunkach granicy faz powietrze-ciecz, w wyniku czego powstają organoidy 3D składające się z dojrzałych neuronów dopaminergicznych.

Protokół

1. Organoidy dopaminergiczne pochodzące z hESC do badań nad chorobą Parkinsona (PD)

1. Dzień 0: Amplifikacja hESC w hodowli 2D do 60% konfluencji (dzień 0), a następnie zastąpienie pożywki z komórek macierzystych stosowanych do utrzymania cech pluripotencji hESC pożywką wolną od surowicy. Rozpocznij indukcję neuronalną od uzupełnienia pożywki hodowlanej o 0,5 μM inhibitora białka morfogenetycznego kości (BMP) i 10 μM transformującego czynnika wzrostu beta (TGFβ)/inhibitora aktywiny/węzłów (koktajl inhibicyjny dual-SMAD), a następnie dodaj inhibitor 10 μM kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) przez 24 godziny, aby zwiększyć przeżywalność komórek podczas pasażu.
2. Dzień 1: Przygotuj płytkę mikrodołkową z 2,5 ml na dołek pożywki bez surowicy uzupełnionej 0,5 μM inhibitorem BMP, 10 μM TGFβ/aktywiną/inhibitorem węzłowym i 10 μM inhibitorem ROCK. Aby określić komórki w kierunku brzusznego wzorca cewy nerwowej, dodaj 100 ng / ml sonic hedgehog (SHH), 100 ng / ml czynnika wzrostu fibroblastów 8 (FGF8) i 2 μM wygładzonego agonisty. Odwirować płytkę (tylko z pożywką i bez komórek) przy 1200 x g przez 5 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z mikrostudzienek.
   1. Po 1 dniu indukcji neuronalnej w 2D usuń pożywkę i szybko przemyj solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez Ca²⁺ / MgCl²⁺. Oddzielić kolonie w zawiesinie pojedynczych komórek, dodając 7,5 ml rekombinowanego roztworu enzymatycznego do kolby T75 cm². Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, a następnie uzupełnić 7,5 ml zmodyfikowanej mieszanki pożywki Eagle i składników odżywczych F-12 (DMEM-F12) firmy Dulbecco.
   2. Zebrać zawiesinę komórek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i policzyć komórki w tym samym podłożu, które użyto do przygotowania płytki mikrodołkowej.
   3. Dostosuj objętość pożywki, aby uzyskać zawiesinę komórek pozwalającą na tworzenie neurosfer zawierających 1000 komórek na mikrodołek (na przykład zastosowana tutaj płytka mikrodołka zawiera 4,700 mikrodołków na studzienkę). Przygotuj więc 4,7 miliona komórek w 2,5 ml pożywki i dodaj ją do poprzednich 2,5 ml pożywki już umieszczonej na płytce.
   4. Aby prawidłowo rozprowadzić komórki w każdej mikrostudzince, delikatnie potrząśnij płytką i odwiruj płytkę mikrodołka 300 x g przez 5 minut. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w celu wytworzenia kulek.
3. Dzień 2: Delikatnie przepłucz mikrodołki pożywką i zbierz, a następnie przenieś kulki na płytkę sześciodołkową poddaną działaniu tkanki. Zastąp pożywkę pożywką Neurobasal uzupełnioną o 1% witaminy B27, 1x aminokwasy endogenne (NEAA), 2 mM L-glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny. Dodatkowo dodaj czynniki regionalizacji SHH, FGF8, wygładzonego agonistę i małe cząsteczki hamujące podwójny SMAD.
   1. Umieścić kule w ruchu obrotowym w temperaturze 37 °C (60 obr./min, wytrząsarka orbitalna) i zmieniać pół pożywki świeżo uzupełnionej co 2-3 dni.
4. Dzień 3: Aby zwiększyć indukcję neuronalną i przekształcić się w neuronalne komórki progenitorowe z tożsamością śródmózgowia, uzupełnij pożywkę inhibitorem kinazy syntazy glikogenu 3 μM beta (GSK-3β), który aktywuje szlak Wnt / β-kateniny. Utrzymuj inhibitor GSK-3β w pożywce do 13 dnia. Podziel na dwie nowe 6-dołkowe płytki poddane działaniu tkanki, aby zmniejszyć gęstość kulek na studzienkę i uniknąć agregacji kul.
   nuta: W dniu 8 większość komórek powinna być dodatnia na obecność Nestin.
5. Dzień 8: Rozpocznij dojrzewanie neuronalne: zastąp czynniki regionalizacji SHH, FGF8, wygładzonego agonistę i koktajl hamujący podwójny SMAD 0,5 mM cyklicznym monofosforanem adenozyny dibutyrylu (cAMP) (w celu ułatwienia dojrzewania), inhibitorem deacetylazy histonowej 20 nM (do wyjścia z cyklu komórkowego), inhibitorem 1 μM γ-sekretazy i czynnikami wzrostu, czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z linii komórek glejowych 10 ng/ml (GDNF), Czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego 10 ng / ml (BDNF), 1 ng / ml transformujący czynnik wzrostu β3 (TGFβ3) i czynnik wzrostu fibroblastów 20 o stężeniu 5 ng / ml (FGF20) (oba sprzyjają przeżyciu progenitora dopaminergicznego [DA]). Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.
6. Dzień 21: Wygeneruj organoid nerwowy: zasiej około 100 neurosfer w warunkach granicy faz powietrze-ciecz na politetrafluoroetylenie (membrana PTFE, średnica 6 mm). Przenieś błonę do wkładki płytki hodowlanej (0,4 mm) i dodaj 1,2 ml pożywki do dojrzewania neuronów używanej do różnicowania neurosfery, jak opisano wcześniej.
   1. Zatrzymaj obrót od tego kroku. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni, aż do osiągnięcia wymaganego punktu czasowego różnicowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka 6-dołkowa (płytka 6-dołkowa)	Sokół / Corning	07-201-588
Aggrewell 400 (płytki do hodowli mikrostudzienek)	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 34421
B27 suplementy (B27)	Technologie życiowe / Invitrogen	1238	Dla obu protokołów, roztwór podstawowy 100x, roztwór końcowy 1x
Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)	Wskazówki dotyczące komórek	Zobacz materiał GFH1-2	Dla obu protokołów, roztwór podstawowy 100 μg/ml w czystym H2O, roztwór końcowy 20 ng/ml
CHIR-99021 (inhibitor GSK-3β)	Axon Medchem	Zobacz materiał ct99021	Dla protokołu dopaminergicznego, roztwór podstawowy 7,5 mM w DMSO, roztwór końcowy 3 μM
Związek E a inhibitor γ-sekretazy (inhibitor γ-sekretazy)	Calbiochem (Elektrownia Jądrowa)	CAS 209986-17-4	Dla obu protokołów (inhibitor gamma-sekretazy XXI), roztwór podstawowy 5 mM w DMSO, roztwór końcowy 1 μM
Dibutyryl cykliczny-AMP (Dibutyryl cAMP)	Sigma	Zobacz materiał D0627	Dla protokołu dopaminergicznego, roztwór podstawowy 0,5 M w DMSO, roztwór końcowy 0,5 mM
Zmodyfikowana mieszanka Eagle Medium F-12 firmy Dulbecco (DMEM-F12)	Gibco (firma Gibco)	11320033	Do hodowli komórkowych, gotowy do użycia
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Technologie życiowe	Zobacz materiał AM9912	Do hodowli komórkowych, gotowy do użycia
Czynnik wzrostu fibroblastów 20 (FGF20)	Peprotech	100-41	Dla protokołu dopaminergicznego, roztwór podstawowy 100 μg/ml w czystym H2O, roztwór końcowy 5 ng/ml
czynnik wzrostu fibroblastów 8 (FGF8)	Peprotech	GFH176-5	Dla protokołu dopaminergicznego roztwór podstawowy 100 μg/ml w czystym H2O, roztwór końcowy 100 ng/ml
Czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF)	Wskazówki dotyczące komórek	Zobacz materiał GFH2-2	Dla obu protokołów, roztwór podstawowy 100 μg/ml w czystym H2O, roztwór końcowy 20 ng/ml
Hydrofilowa membrana politetrafluoroetylenowa (membrana PTFE)	Interfejs BioCell	Przerwać
LDN-193189 (inhibitor BMP)	Axon Medchem /Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, roztwór podstawowy 5 mM w DMSO, roztwór końcowy 0,5 μM
L-glutamina (L-glutamina)	Gibco (firma Gibco)	25030081	L-glutamina (200 mM), roztwór podstawowy 200 mM, roztwór końcowy 2 mM
Millicell-CM Wkładka do płytki hodowlanej (0,4 μm) (Wkładka do płytki hodowlanej)	Milipory	PICM03050
Wytrząsarka orbitalna MS, MS-NOR-30 (Wytrząsarka orbitalna)	Kierunek nauki	Przekaźnik MS-NRC-30
Suplementy N2 (N2)	Invitrogen	Numer katalogowy: 17502-048	Do hodowli GIC roztwór podstawowy 100x, roztwór końcowy 1x
Neuropodstawowy (Neurobazalny)	Technologie życiowe / Gibco	21103049	Utrzymanie i dojrzewanie embrionalnych populacji komórek neuronalnych, gotowych do użycia
Aminokwasy endogenne (NEAA)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 11140	Aminokwasy endogenne 100X, roztwór podstawowy 100x, roztwór końcowy 1x
Nutristem (pożywka z hESC)	Przemysł biologiczny	05-100-1A	Pożywka z komórek macierzystych, gotowa do użycia
Penicilin / Streptomycyna (Penicilina / Streptomycyna )	Technologie życiowe / Gibco	15140122	Do hodowli komórkowych roztwór podstawowy 5 mg/ml, roztwór końcowy 50 μg/ml
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+/Mg2+ (PBS bez Ca2+/ Mg2+ )	Technologie życiowe	14190250	Do hodowli komórkowych, gotowy do użycia
Purmorphamina (wygładzony agonista)	Calbiochem (Elektrownia Jądrowa)	SML0868	Dla protokołu dopaminergicznego, roztwór podstawowy 10 mM w DMSO, roztwór końcowy 2 μM
Kinaza Y-27632 związana z rho (ROCK)	Abcam Biochemikalia	AB120129-1	Inhibitor skał, roztwór podstawowy 50 mM w DMSO, roztwór końcowy 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activina/Inhibitor węzłowy)	wzniesienie	Asc- 163	Dual-Smad, roztwór podstawowy 50 mM w DMSO, roztwór końcowy 10 μM
Jeż dźwiękowy (SHH)	Wskazówki dotyczące komórek	GFH168-5	Dla protokołu dopaminergicznego roztwór podstawowy 100 μg/ml w czystym H2O, roztwór końcowy 100 ng/ml
StemPro Accutase (roztwór enzymatyczny hESC)	Gibco (firma Gibco)	A11105-01	Roztwór enzymatyczny hESC, gotowy do użycia
Kolba T150 (kolba T150)	sokół	08-772-1F
Transformujące czynniki wzrostu beta 3 (TGFβ3)	Wskazówki dotyczące komórek	GFH109-2	Dla protokołu dopaminergicznego, roztwór podstawowy 100 μg/ml w czystym etanolu, roztwór końcowy 1 ng/ml
Trichostatyna A (inhibitor deacetylazy histonowej )	Sigma	Zobacz materiał T8552	Dla protokołu dopaminergicznego, roztwór podstawowy 100 μM w DMSO, roztwór końcowy 20 nM
TrypLE (rekombinowany roztwór enzymatyczny)	Invitrogen	12604021	Rekombinowany roztwór enzymatyczny, gotowy do użycia
Trypsyna 0,25% (roztwór enzymatyczny)	Technologie życiowe	15050065	roztwór enzymatyczny, gotowy do użycia
X-vivo (pożywka wolna od surowicy)	Lonza	BE04-743Q	Pożywka SUROWICA FREE, gotowa do użycia

SZT. powiedział: powiedział: powiedział: TGL