$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Cewnikowanie tętnicze
- Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy i ksylazyny oraz środkiem przeciwbólowym zgodnie z lokalną praktyką (np. buprenorfiną). Uszczypnij tylne kończyny kleszczami, aby potwierdzić prawidłową głębokość znieczulenia.
nuta: W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6N w wieku 8-12 tygodni (waga 20-25 g). Autorzy bezskutecznie testowali męskie BALB/c w tym samym wieku, ale nie próbowali innych szczepów.
- Usuń włosy w obszarach zainteresowania (głowa, szyja) za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Upewnij się, że nie pozostały żadne luźne włosy, aby zapobiec zanieczyszczeniu rany. Następnie zdezynfekuj pole operacyjne 70% etanolem/chlorheksydyną/betadyną i ułóż mysz na wznak z głową skierowaną w stronę chirurga.
- Wykonaj nacięcie linii środkowej szyjki macicy nożyczkami preparacyjnymi.
- Wypreparuj gruczoły podżuchwowe i tkankę mięśniową szyi i oddziel je w celu odsłonięcia wspólnej tętnicy szyjnej. Stosuj głównie rozwarstwianie za pomocą kleszczy.
- Miejsce trzecie 8-0 Ligatury jedwabne poniżej prawej tętnicy szyjnej wspólnej.
- Umieść zacisk na podwiązaniu proksymalnym i wprowadź napięcie do tętnicy, aby przepływ został zawieszony.
- Zamknij najbardziej dystalną ligaturę.
- Wprowadzić cewnik tętniczy przez mały, wstępnie uformowany otwór skórny po stronie czaszki nacięcia. Ściśnij i odkształc światło cewnika, jeśli wydaje się zbyt duże, aby zmniejszyć cofanie się krwi. Zafiksuj się wszystkimi trzema ligaturami.
- Przymocuj cewnik do skóry, aby uniknąć zwichnięcia. Zrób to za pomocą szwu (np. żyłki 5-0, niewchłanialnej), który łączy cewnik ze skórą w obszarze wstępnie uformowanego otworu skórnego.
2. Tracheostomia
- Tępo wypreparuj mięśnie przedtchawicze za pomocą kleszczy.
- Miejsce dwa 8-0 jedwabne ligatury pod tchawicą.
- Tracheotomia za pomocą mikronożyczek tak proksymalnie, jak to możliwe, aby uniknąć jednostronnej wentylacji. Użyj poziomej linii cięcia między dwiema chrząstkami tchawicy.
- Włóż rurkę wentylacyjną i zamocuj za pomocą obu przygotowanych ligatur.
nuta: Proksymalny koniec tchawicy nie musi być podwiązany.
- Zamknij skórę szwem biegnącym (np. żyłka 6-0, niewchłanialna).
- Przewietrzyć mysz z częstotliwością 150/min i objętością oddechową 200 μl.
3. Indukcja śmierci mózgu (BD)
- Ustaw mysz w pozycji leżącej.
- Usuń skórę z czaszki za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby przytrzymać skórę.
- Wywierć otwór o kalibrze 1 mm przyśrodkowo nad lewą korą ciemieniową. Przerwij wiercenie przed naruszeniem wewnętrznej zwartej kości i opony twardej.
- Przeniknij do końcowego mostu tkankowego czaszki za pomocą kleszczy, usuwając ostre krawędzie.
- Wprowadzić cewnik balonowy tak, aby znajdował się całkowicie w jamie czaszki. Upewnij się, że balon jest wstępnie napełniony solą fizjologiczną i całe powietrze zostało usunięte.
- Rozpocznij napełnianie od ~0,1 ml/min przez okres 10-15 min (całkowita objętość 0,8-1,2 ml) za pomocą pompy strzykawkowej.
nuta: Mysz będzie wykazywać mioklonie, rozszerzenie źrenic, dalszą aktywność napadową i agonalne westchnienia.
- Ogłoś śmierć mózgu myszy, gdy ogon myszy zesztywnieje i wyprostuje się.
nuta: ChAD potwierdza charakterystyczny początkowy szczyt ciśnienia krwi (odruch Cushinga), brak odruchów pnia mózgu i spontaniczny oddech. Podczas eksperymentów należy unikać regularnych testów bezdechu, ponieważ myszy mogą stać się niestabilne w krążeniu z powodu braku tlenu.
- Zatrzymaj nadmuchiwanie cewnika balonowego.
- Połóż koc grzewczy na myszy, aby uniknąć hipotermii.