UWAGA: Linie transgeniczne użyte w tym badaniu obejmują specyficzną dla makrofagów linię mpeg1:mCherry (skonstruowaną wewnętrznie), specyficzną dla neutrofili mpo: GFP, specyficzną dla erytroidu gata1:dsRed i ubiq:secAnnexinV-mVenus, reporter śmierci komórki (ponownie uzyskany w domu) na tłach typu dzikiego, masy perłowej (mitfaw2/w2) i mutanta (bbhm292).
1. Dzień 0: Produkcja i zbiór jaj
- Zbieraj zapłodnione zarodki z naturalnego tarła w skrzynkach hodowlanych wyprodukowanych z 1 samca i 1-2 samic dorosłego danio pręgowanego.
nuta: W protokole atorwastatyny można użyć dowolnych zwierząt typu dzikiego/transgenicznego; Jednak częstość krwotoków różni się nieznacznie między szczepami.
- Inkubować 100 zarodków w temperaturze 28 °C w standardowym pożywce dla zarodków E3 na szalkę Petriego i etapizować zgodnie ze standardowymi wytycznymi.
- Po ~6 godzinach od zapłodnienia (hpf) usuń martwe i niezapłodnione zarodki z naczynia za pomocą pipety Pasteura. Rysunek 1 przedstawia oś czasu eksperymentu.
2. Dzień 1: Leczenie atorwastatyną w dawce 24 hpf
- Dekorionate zarodki do leczenia atorwastatyną za pomocą ostrych, ultracienkich kleszczy preparacyjnych. Liczby wymagane do eksperymentowania można odpowiednio dostosować.
- Dodać 30 ml pożywki z zarodków E3 do dwóch czystych szalek Petriego. Użyj jednego naczynia na 100 zarodków.
nuta: Jeśli płytki są przeznaczone do hodowli komórkowych, zegmunowany danio pręgowany na tym wczesnym etapie często przykleja się do dna. Aby tego uniknąć, przed użyciem dokładnie opłucz płytki w czystej wodzie.
- Usunąć 60 μl wody z zarodków z płytki zabiegowej i dodać 60 μl 0,5 mM atorwastatyny (ATV). Przy stężeniu podstawowym 0,5 mM, powyższe rozcieńczenie spowoduje końcowe stężenie 1 μM, co spowoduje ~20% larw bez krwotoku (ICH-) i ~80% larw krwotoków (ICH+). Drugą płytkę należy stosować w przypadku kontroli niepoddanych obróbce.
nuta: Atorwastatyna jest rozpuszczana w wodzie destylowanej (3 mg w 10 ml) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 0,5 mM. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności z mieszaniem, ponieważ rozpuszczanie zajmuje trochę czasu. Całkowita rozpuszczalność może potrwać do 1 tygodnia. Nie stosować DMSO (dimetylosulfotlenku). Roztwór jest podawany i przechowywany w temperaturze -20°C. Nie zamrażać i nie rozmrażać.
- Za pomocą pipety Pasteura przenieś 100 zarodków w jak najmniejszej ilości wody na płytki zabiegowe.
- Inkubować płytki w temperaturze 28 °C.
nuta: ICH (krwotok śródmózgowy) wystąpi między 33 a 48 hpf. Atorwastatyna nie musi być usuwana, ponieważ inkubacja trwała dłużej niż 24 godziny nie powoduje żadnych dalszych problemów rozwojowych.
3. Dzień 2: Separacja populacji ICH- i ICH+ przy 50 hpf
- Oddziel ryby ICH+ od populacji ICH- i przenieś je do nowych potraw dla ułatwienia.
- W przypadku stosowania modelu ATV przy stężeniu 1 μM, 75-100% larw będzie wykazywać krwotok (ICH+) w tym punkcie czasowym.
nuta: Reakcja larw różni się w zależności od szczepu, jeśli larwy nie krwotoczą z pożądaną częstotliwością, użyj świeżej partii atorwastatyny lub o wyższym stężeniu. Jeśli larwy nie wykazały krwotoku o 48 hpf, należy je uznać za ICH-.
- W przypadku korzystania z modelu bbh, wszystkie homozygotyczne mutanty będą wykazywać krwotok o 48 hpf. W przypadku stosowania heterozygotycznego krzyżowania, heterozygotyczne i dzikie rodzeństwo ICH- może być używane jako zwierzęta kontrolne do eksperymentów.
- W razie potrzeby znieczulić larwy, dodając 0,02% MS222 do pożywki E3. Za pomocą pipety Pasteura posortuj larwy pod kątem obecności krwi w głowie na świeże podłoże E3. Patrz rysunek 2.
nuta: Krew w głowie może pojawić się w przednim, środkowym lub tylnym mózgu lub w połączeniu, a objętość krwawienia może się różnić u poszczególnych zwierząt. U mutantów bbh ICH jest często związany z ciężkim obrzękiem, który można rozpoznać po większych głowach, szerszej przestrzeni między oczami i bardziej rozlanym krwawieniu. Jednak nie wszystkie larwy ICH+ bbh wykazują obrzęk.
