Barwienie immunofluorescencyjne sialoglykoprotein w neuronalnych komórkach progenitorowych i neuronach

Streszczenie

Źródło: Bai, Q., et al., Identyfikacja markerów powierzchni komórek pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez metaboliczne znakowanie sialoglykanu. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film demonstruje biotynylację i fluorescencyjne znakowanie zmodyfikowanych sialoglykoprotein w pierwotnych nerwowych komórkach macierzystych i progenitorowych, a także neuronach, oraz ich wizualizację za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Protokół

1. Barwienie immunofluorescencyjne sialoglykoprotein w rozszerzonych pierwotnych NSPC i zróżnicowanych neuronach

1. Przygotować kompleks BTTAA-CuSO₄ 1 30x bulion zawierający 1,5 mM CuSO₄ i 9 mM BTTAA w wodzie podwójnie destylowanej. Przygotować świeżo sprzężony z biotyną bufor 1 zawierający 50 μM biotyny-alkinu, 2,5 mM askorbinianu sodu i 1x kompleks_BTTAA-CuSO4 w PBS.
2. Usuń wkładki z płytek współkulturowych. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków dolnych i raz umyć komórki nerwowe wstępnie podgrzanym PBS.
3. Odessać PBS ze studzienek. Dodać 1 ml wstępnie schłodzonego 4% roztworu PBS paraformaldehydu na dołek do komórek i utrwalić je w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umyj komórki 3 razy wstępnie schłodzonym PBS.
4. Odessać PBS z dołków i dodać do komórek 1 ml świeżo przygotowanego buforu sprzężonego z biotyną 1 na studzienkę. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
5. Odessać bufor reakcyjny ze studzienek. Umyj komórki 3 razy PBS. Przygotować bufor barwiący zawierający 1% FBS i 1 μg/ml Alexa Fluor 647-streptawidyny. Dodać 1 ml buforu barwiącego na dołek do komórek i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
6. Odessać bufor barwiący ze studzienek i przemyć komórki 3 razy wstępnie schłodzonym PBS. Przygotować bufor blokujący zawierający 5% BSA i 0,3% niejonowego detergentu-100 w PBS. Dodać 1 ml buforu blokującego na studzienkę do komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
7. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając razem przeciwciała anty-nestyny i anty-β-tubuliny III w buforze blokującym w proporcjach odpowiednio 1:20 i 1:1 000. Usuń bufor blokujący z dołków i dodaj 1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na studzienkę do komórek. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez noc.
8. Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z dołków. Umyj komórki 3 razy wstępnie schłodzonym PBS. Przygotuj drugorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając razem Alexa Fluor 488 kozią anty-mysią IgG1, Alexa Fluor 546 kozią anty-mysią IgG2b i DAPI w bufor blokujący w rozcieńczeniu 1:1,000. Odessać PBS z dołków i dodać 1 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych na studzienkę do komórek. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
9. Odessać roztwór przeciwciała ze studzienek i umyć komórki 3 razy wstępnie schłodzonym PBS. Następnie komórki są gotowe do przechwycenia obrazu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	10099141	10%
Paraformaldehyd	Sigma	158127	4 proc
DAPI (interfejs DAPI)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 62248
Płytka 6-dołkowa	Corning	3335
Mysia monoklonalna anty-Nestin	Badanie rozwojowe Hybridoma Bank	Szczur-401	od 1 do 20
Mysia monoklonalna anty-tubulina III	Sigma	Zobacz materiał T8860	od 1 do 1000
Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG1	Invitrogen	A-21121	od 1 do 1000
Alexa Fluor 546 kozia anty-mysia IgG2b	Invitrogen	A-21143	od 1 do 1000
Tryton X-100	Amresco (angielski)	694
Siarczan miedzi	Sigma	209198
Alkino-biotyna	Kliknij Narzędzia chemiczne	TA105
Protokół BTTAA	Kliknij Narzędzia chemiczne	1236
askorbinian sodu	Sigma	A4034
Alexa Mąka 647-sprzężona streptawidyna	Invitrogen	Zobacz materiał S21374	od 1 do 1000

. TGL powiedział: TGL powiedział: szt. (wersja angielska)