Ocena in vitro zagregowanego β amyloidu na zapadanie się stożka wzrostu neuronów

Streszczenie

Źródło: Kuboyama, T. Wizualizacja zapadania się stożka wzrostu aksonów i wczesnych efektów β amyloidu w hodowanych neuronach myszy. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje ocenę in vitro zapadania się stożka wzrostu neuronów przez agregaty amyloid-β (Aβ). Traktowanie neuronów agregatami Aβ powoduje destabilizację cytoszkieletu, prowadzącą do zapadnięcia się stożków wzrostu na końcach aksonów. Leczone komórki porównuje się z komórkami kontrolnymi w celu oceny stopnia zapadania się stożka wzrostu.

Protokół

1. Test zwijania

1. Cynowanie poli-D-lizyną
   1. Pokryć 8-dołkowe szkiełka hodowlane 400 μl 5 μg/ml poli-D-lizyny (PDL) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować je w temperaturze 37 °C przez noc.
   2. Usuń roztwór PDL i umyj studzienki 3 razy wodą destylowaną.
2. Hodowla neuronów
   1. Zmiel świeżo wyizolowaną korę mózgową od embrionalnych myszy ddY (Deutschland, Denken i Yoken) dnia 14 (E14) za pomocą mikronożyczek w pożywce do hodowli neuronów zawierającej 12% surowicy końskiej, 0,6% glukozy i 2 mM L-glutaminy (pożywka A). Nie dodawać antybiotyków.
      nuta: W tym protokole używana jest mysz ddY. Jest to odmiana niekrewniacza powszechnie stosowana w Japonii. Ten protokół hodowli neuronów może być również stosowany do neuronów korowych szczurów.
   2. Odwirować tkanki przy sile 87 x g przez 3 minuty.
   3. Usunąć supernatant. Następnie do granulatu dodaj 2 ml 0,05% trypsyny i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37°C. Mieszaj, stukając co 5 minut.
   4. Dodaj 4 ml pożywki A i wymieszaj, stukając.
   5. Odwirować tkanki przy sile 178 x g przez 3 minuty.
   6. Usunąć sklarowany nadłat i inkubować tkanki z 600 j./ml dezoksyrybonukleazy I (DNazy I) i 0,3 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej rozpuszczonego w PBS przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Mieszać stukając co 5 minut.
   7. Po inkubacji dodać 4 ml pożywki A i wymieszać, stukając.
   8. Odwirować tkanki przy sile 178 x g przez 3 minuty.
   9. Po usunięciu supernatantu dodać 4 ml pożywki A i rozcierać tkanki za pomocą wypolerowanej pipety Pasteura.
   10. Przefiltruj rozdrobnione tkanki za pomocą siatki o wielkości porów 70 μm. Po filtracji oblicz gęstość komórek za pomocą hemocytometru.
   11. Wyhodować komórki w 8-dołkowym szkiełku hodowlanym w temperaturze 0,8 x 10⁴ komórki/basenik z pożywką A i utrzymać je w inkubatorze CO₂ z nawilżoną atmosferą 10% CO₂ w temperaturze 37 °C.
   12. Po 4 godzinach hodowli należy wymienić pożywkę hodowlaną na taką, która zawiera 2% suplementu do hodowli neuronów, 0,6% glukozy i 2 mM L-glutaminy (pożywka B).
       nuta: Czystość neuronów wynosiła około 75%, jak opisano wcześniej.
3. Test zapadania się
   1. Rozpuścić komercyjnie uzyskany amyloid β1-42 (Aβ1-42) o pełnej długości w wodzie destylowanej o stężeniu 0,5 mM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 dni. Po inkubacji zagregowany roztwór Aβ1-42 należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -30 °C do momentu użycia.
      nuta: Ta inkubacja jest niezbędna do agregacji i toksyczności Aβ.
   2. Po 4 dniach hodowli neuronalnej potraktować studzienki 100 μl nowej pożywki B, zawierającej 0,5 μM zagregowanego Aβ1-42 lub roztworu nośnika (woda destylowana) przez 1 h,
      nuta: Efekty Aβ1-42 były zwiększane w zależności od dawki z 0,1 do 5 μM i osiągały maksimum przy 0,5 μM, jak opisano wcześniej. Podobne wyniki można zaobserwować przy leczeniu Aβ1-42 przez 1 godzinę po 3 dniach hodowli neuronów.
   3. Usunąć pożywkę hodowlaną i natychmiast utrwalić neurony 4% paraformaldehydem zawierającym 4% sacharozy w PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C na gorącej płycie.
   4. Po utrwaleniu przemyj neurony 3 razy PBS i zamontuj je wodnym podłożem montażowym. Podłoże montażowe suszyć w temperaturze 4 °C przez 2–4 dni.
   5. Uchwyć cały obszar (7,8 x 9 mm²) każdej studzienki za pomocą 20-krotnej suchej soczewki obiektywowej w odwróconym mikroskopie.
   6. Sklasyfikuj najdłuższe neuryty każdego neuronu w stadium 3 lub 4 jako aksony, jak opisano wcześniej.
   7. Klasyfikuj stożki wzrostu według następujących kryteriów: 1) aksonalne stożki wzrostu pozbawione blaszek lub 2) posiadające mniej niż trzy filopodia są uważane za zapadnięte stożki wzrostu, jak opisano wcześniej.
      nuta: Zdrowe stożki wzrostu są oceniane jako 0 punktów; Zapadnięte stożki wzrostu są oceniane jako 1 punkt. Średnie wyniki zapadnięcia są obliczane dla każdego zabiegu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy ddY	Slc
Szkiełko hodowlane z ośmioma dołkami	sokół	354108
poli D lizyna	Wako	Nr kat. 168-19041
Pożywka hodowlana, pożywka neuropodstawowa	Gibco (firma Gibco)	21103-049
Serum domowe	Gibco (firma Gibco)	26050-088
glukoza	Wako	Numer katalogowy: 049-31165
L-glutamina	Wako	Numer katalogowy: 074-00522
0,05% trypsyny	Gibco (firma Gibco)	25300-054
DNaza I	Worthington	Dp
inhibitor trypsyny sojowej	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17075-029
Filtr o rozmiarze oczek 70 μm, sitko do komórek	sokół	Numer katalogowy: 352350
Suplement B-27	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17504-044
Inkubator emisjiCO2	Astec powiedział:	Zobacz materiał SCA-165DS
Amyloid β1-42	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał A9810
paraformaldehyd	Wako	Nr kat. 162-16065
sacharoza	Wako	196-00015
Wodne medium montażowe, AquaPoly/Mount	Politechniki	Lata 18606-20
Mikroskop odwrócony A	Carl Zeiss	Obserwator Axio Z1	Połączony z AxioCam MRm, jednostką grzewczą XL S, modułem CO2 S1 i modułem TempModule S1
Obiektyw planapochromatyczny 20x	Carl Zeiss	Numer telefonu 420650-9901