Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie przekrojów tkanek do obrazowania spektrometrii mas (IMS)
- Przetwarzanie próbki tkanki ludzkiego mózgu poddanego autopsji
nuta: Upewnij się, że etap przygotowania próbki do IMS zachowuje oryginalny stan tkanki. Unikaj zanieczyszczenia i zmian poubojowych. Następny krok jest kluczowy.
- Pobranie próbek kory mózgowej człowieka do IMS z mózgów, które zostały usunięte, przetworzone i przechowywane w temperaturze -80 °C w ciągu 8 godzin po sekcji zwłok. Weź próbkę mózgu z kory potylicznej pacjentów z chorobą Alzheimera (AD) i osób z grupy kontrolnej w tym samym wieku.
- Przygotowanie zamrożonych skrawków tkanek
- Wytnij skrawki tkanki na kriostacie. Umieść przewodzące szkiełka mikroskopowe pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) wewnątrz kriostatu.
- Ogrzej próbkę mózgu z autopsji od -80 °C do -22 °C wewnątrz kriostatu.
- Do każdego eksperymentu należy przymocować nowe jednorazowe ostrze do kriostatu. Zawsze staraj się używać czystej części ostrza.
- Umieść zamrożone mózgi z autopsji na scenie wraz z niewielką ilością związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (wystarczająco, aby pokryć środkową część sceny; patrz Tabela Materiałów).
- Wybierz warunki do cienkiego przekroju. W przypadku IMS należy użyć grubości 10–12 μm dla przekrojów ludzkiego mózgu. W przypadku IMS i immunohistochemii (IHC) należy wyciąć od pięciu do sześciu odcinków z każdej próbki tkanki.
- Gdy ostrze dopiero zaczyna ciąć tkankę, obróć koło i "skieruj" się w stronę bloku, aż cała tkanka zostanie odsłonięta. Jeśli w poprzek sekcji znajduje się niewielka smuga lub rozdarcie, poczekaj trochę dłużej w kriostatu, aż regulacja temperatury automatycznie ją naprawi. Policz kilka sekund przed otwarciem anti-rolla z chusteczką pod spodem.
- Natychmiast umieść plasterek chusteczki po stronie szkła pokrytej ITO. Rozmrozić plasterek tkanki, wkładając palec pod szkiełko po stronie niepokrytej ITO. Tkanka przyklei się do szkiełka; Upewnij się, że tkanka jest tak płaska, jak to możliwe, bez zmarszczek. Wykonaj ten krok w temperaturze pokojowej.
nuta: Noś rękawice, maski i fartuch laboratoryjny, ponieważ próbki ludzkie mogą zawierać zanieczyszczenia biologiczne. Gdy wszystkie sekcje zostaną wykonane na dany dzień, wyczyść kriostat, szczotki i uchwyty chusteczkami laboratoryjnymi i 200 ml 100% etanolu.
- Płukanie skrawków tkanek
- Zanurz próbki w 40–100 ml 70% etanolu na 30 sekund, aby usunąć endogenne lipidy i sole nieorganiczne. Użyj szklanego słoika do barwienia.
- Płucz próbki 40–100 ml 100% etanolu przez 30 s, 40–100 ml roztworu Carnoya przez 3 minuty, 40–100 ml 100% etanolu przez 30 s, 40–100 ml 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) przez 1 minutę i 40–100 ml 100% etanolu przez 30 s. Użyj szklanego słoika do barwienia.
nuta: Roztwór Carnoya jest utrwalaczem składającym się z sześciu części etanolu, trzech części kwasu octowego i jednej części chloroformu.
- Suszyć w próżni przez 30 min.
- Traktowanie skrawków tkanek parą kwasu mrówkowego w celu lepszej jonizacji białek Aβ z tkanek mózgowych z autopsji
- Przygotuj szkiełko do piekarnika i inkubacji, które zostaną użyte do późniejszej waporyzacji za pomocą 5 ml 100% kwasu mrówkowego. Aby uzyskać zadowalającą kwasowość, należy utrzymywać wilgotność powietrza w szklanym naczyniu inkubacyjnym na poziomie nasycenia przez cały ten etap i utrzymywać temperaturę na poziomie 60 °C. Umieścić szkiełka tkankowe w szklanym naczyniu do inkubacji, unikając zanurzania w kwasie mrówkowym i leczyć przez 6 minut.
- Wykonaj obraz optyczny próbek za pomocą skanera do filmów, skanera żelowego, mikroskopu cyfrowego itp. Wykonaj ten krok w temperaturze pokojowej. Wyrównanie obrazu optycznego próbek jest konieczne, gdy cel próbki jest umieszczony wewnątrz urządzenia. Zazwyczaj nie będzie możliwe rozpoznanie odcinka tkanki znajdującego się pod warstwą matrycy.
UWAGA: Najwygodniejszym sposobem wykonania obrazu optycznego jest użycie skanera biurowego. Dobrym pomysłem jest zapisanie obrazu w folderze przechowywania danych obrazowania.
- Aby skorelować obrazy optyczne z próbkami, należy wykonać znaki prowadzące, które są widoczne zarówno na obrazie optycznym, jak i pod warstwą matrycy w optyce kamery. Najprostszym sposobem jest dostrzeżenie co najmniej trzech śladów płynu korekcyjnego wokół próbki przed wykonaniem obrazu optycznego.
- Aplikacja Matrix
- Przygotowanie roztworu matrycowego
- W mikroprobówce tolerującej rozpuszczalniki organiczne przygotuj 10 mg/ml roztworu kwasu synapinowego (SA) w 50% acetonitrylu (ACN) i 0,1% TFA. Dokładnie rozpuścić związek SA przez wirowanie lub krótką sonikację przez 10 minut. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
UWAGA: Istnieją trzy różne opcje natryskiwania matrycy: za pomocą aerografu, opryskiwacza ultradźwiękowego lub opryskiwacza automatycznego.
- Natryskiwanie matrycy aerografem
- Operację należy wykonywać w stałej temperaturze pokojowej (20–23 °C) i wilgotności (40–60%). Parametry, które należy dostosować w celu optymalnego oprysku, obejmują wielkość kropli, ilość mgły, kąt i odległość między dyszą natryskową a sekcją tkanki oraz temperaturę i wilgotność w laboratorium. Dostosuj te warunki, sprawdzając wyniki mikroskopii.
nuta: Ponieważ czynniki ograniczające obejmują wielkość kryształów i jednorodność pokrycia matrycy oraz niepożądaną migrację/dyfuzję analitów, im mniej, tym lepiej dla wielkości kropli. Jednorodność jest również punktem kontroli.
- Natryskiwanie matrycy za pomocą opryskiwacza ultradźwiękowego
- Wyjąć tkankę przeznaczoną do rozpylenia z eksykatora i umieścić ją w komorze. Upewnij się, że chusteczka nie zakrywa okienka czujnika.
- Rozpocznij przygotowanie, naciskając przycisk Start; zwykle czas przygotowania wynosi około 90 minut. Przygotowanie będzie regulowane automatycznie poprzez monitorowanie grubości warstwy matrycy i wilgotności. Po zakończeniu przygotowania należy wyjąć szkiełko i przechowywać je w eksykatorze przez 15 minut przed odczytaniem w przyrządzie MALDI.
- Wyczyść opryskiwacz 2–3 ml 100% metanolu (MeOH), aż głowica natryskowa będzie wyglądać na czystą.
nuta: Drobna mgiełka kropelek matrycy może zanurzyć się w tkance za pomocą arkusza grawitacyjnego. Generowana jest średnia wielkość kropli 20 μm; Wszystkie średnice kropel są mniejsze niż 50 μm.
- Natryskiwanie matrycy za pomocą automatycznego opryskiwacza
- Rozpyl roztwór matrycy na powierzchnię tkanki za pomocą automatycznego opryskiwacza. Stały przepływ podgrzanego gazu w osłonie (N2, ustawiony na 10 psi i 75 °C) będzie dostarczany razem z natryskiwaniem roztworu matrycy. Użyj systemu pompowania rozpuszczalnika (ustawionego na 10 psi i 0.15 ml/min), aby dostarczyć roztwór matrycy.
nuta: Co najważniejsze, pracuj pod szafką bezpieczeństwa, aby uniknąć wdychania aerozoli matrycowych. Kontroluj temperaturę i wilgotność w pomieszczeniu, aby odtworzyć jednorodną krystalizację matrycy.
2. MALDI-IMS
- Wykonaj ultraszybką spektrometrię mas.
- Wykonuj eksperymenty obrazowania o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą MALDI-IMS wyposażonego w laser z granatu itrowo-aluminiowego domieszkowanego neodymem (Nd:YAG, 355 nm) o częstotliwości 10 kHz.
- W przypadku pomiarów spektrometrii mas należy zdefiniować obszary tkanek za pomocą oprogramowania sterującego MALDI i oprogramowania do analizy danych.
- Pozyskiwanie widm w dodatnim trybie liniowym o zakresie mas m/z 2 000–20 000 i rozdzielczości przestrzennej 20 i 100 μm.
- Aby uzyskać wzorzec kalibracyjny, rozpuść wzorzec kalibracyjny peptydu i wzorzec kalibracji białka w stosunku 1:4 z kwasem alfa-cyjano-4-hydroksylocynamonowym (CHCA) w roztworze TA30 (ACN:0,1% TFA = 30:70), a następnie rozcieńczyć go 10x. Umieść 1 μl wzorca kalibracyjnego na szkiełku w czterech różnych miejscach.
- Korzystając z oprogramowania do histologii molekularnej (patrz tabela materiałów), nałóż na siebie wiele pojedynczych obrazów, aby znaleźć korelację przestrzenną różnych sygnałów, takich jak różne peptydy Aβ kolokalizujące się w blaszkach starczych (SP) i ścianach tętnic.
