Wykrywanie mikrokrwotoków mózgowych w modelu szczurzym

Streszczenie

Źródło: Li, D., Zhào, H., et al. Ten film demonstruje test do wykrywania mikrokrwotoków mózgowych (CMH) w modelu szczurzym. CMH to krwawienia do mózgu spowodowane przerwaniem bariery krew-mózg, identyfikowane przez wyciekające czerwone krwinki (RBC). W modelu szczurzym utrwalona tkanka mózgowa jest kriochroniona, cięta i barwiona hematoksyliną-eozyną dla erytrocytów, co pozwala na mikroskopową wizualizację CMH. Wyciekające erytrocyty pojawiają się pod mikroskopem jako czerwono-pomarańczowe.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Materiały

1. Przygotowanie wtrysku lipopolisacharydu (LPS)
   1. Dodać 25 ml wody destylowanej do 25 mg proszku LPS pochodzącego z Salmonella typhimurium do końcowego stężenia 1 mg/ml. Wstrzyknięcie należy przechowywać w sterylnej probówce o temperaturze 4 °C.
      ostrożność: LPS jest toksyczny.
   2. Przygotuj 2% roztwór błękitu Evansa (EB) w normalnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej, aby utrzymać wstrzyknięcie EB w stężeniu roboczym.

2. Zwierzęta

Podaj LPS samcom szczurów Sprague-Dawley (SD) w wieku 10 tygodni (średnia waga: 280 ± 20 g) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.
ostrożność: Jeśli szczury są kupowane od innej organizacji, faza adaptacyjna nie powinna trwać krócej niż 7 dni.

3. Zastrzyki LPS

1. Każdemu szczurowi należy wstrzyknąć LPS dootrzewnowo w dawce 1 mg/kg mc. i umieścić szczury z powrotem w klatce domowej.
   nuta: Znieczulenie nie jest konieczne.
2. Sześć godzin później wstrzyknij szczurom tę samą dawkę zastrzyku LPS.
3. Szesnaście godzin później wstrzyknij szczurom tę samą dawkę LPS.
   ostrożność: Wstrzykiwanie szczurom z SD LPS w dawce 1 mg/kg mc. może spowodować 5% śmiertelność. Śmiertelność może jeszcze bardziej wzrosnąć u młodszych lub starszych szczurów lub ciężarnych samic szczurów.
4. Po wstrzyknięciu LPS szczury należy umieścić z powrotem w klatkach i zapewnić im dostęp do jedzenia i picia ad libitum.
   nuta: Szczury będą wykazywać wyraźną ogólnoustrojową reakcję zapalną, dlatego ważne jest, aby klatki pozostały czyste przez cały czas trwania eksperymentu. Szczury powinny często (2 razy dziennie) monitorować masę ciała, ogólny wygląd i nastawienie po pierwszym wstrzyknięciu LPS. Jeśli szczury zaczną wykazywać zgarbioną postawę, niechęć do poruszania się, znaczną utratę masy ciała (>20%), zabarwienie porfiryną, że zostaną humanitarnie poddane eutanazji przed punktem końcowym 7-dniowego badania EB.

4. Pobieranie próbek

1. Iniekcja EB
   1. Siedem dni po pierwszym wstrzyknięciu należy znieczulić szczura dootrzewnowo zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC.
   2. Odczekaj 1-2 minuty, aż szczury nie będą wykazywać odruchów rogówkowych. Wykonaj nakłucie serca o głębokości 5–8 mm u każdego szczura; Punkt nakłucia powinien znajdować się 5 mm do lewego brzegu mostka w 3. i 4. przestrzeni międzyżebrowej.
   3. Poczekaj, aż zaobserwuje się regenerację krwi, a następnie wstrzyknąć EB w dawce 0,2 ml/100 g masy ciała do lewej komory serca.
      ostrożność: Nakłucie serca i wstrzyknięcie EB należy wykonać ostrożnie. EB może być wstrzykiwany do klatki piersiowej lub osierdzia zamiast do lewej komory serca.
      1. Odessać z powrotem pustą rurkę i zastąpić tę objętość rurką EB przed wstrzyknięciem, aby zmniejszyć wskaźnik niepowodzeń (np. błędne wstrzyknięcie do klatki piersiowej
      ).
   4. Trzymaj szczura w pozycji leżącej na plecach przez 10 min.
      UWAGA: Jeśli próbka nie jest używana do wykrywania wycieku EB w obrazowaniu immunofluorescencyjnym, ten krok można pominąć.
2. Obserwacja ogólna
   1. Wykonaj perfuzje serca za pomocą lodowatego 1 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS), aby oczyścić naczynia krwionośne mózgu i mózg.
      1. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie brzucha na całej długości przepony.
      2. Przetnij żebra po lewej stronie linii środkowej klatki piersiowej
      .
      3. Otwórz klatkę piersiową. Użyj zacisków, aby odsłonić serce i ułatwić drenaż krwi i innych płynów.
      4. Trzymając stabilnie serce kleszczami (serce powinno nadal bić), bezpośrednio wbij igłę w występ lewej komory, aby przedłużyć go do około 5 mm. Zabezpiecz igłę w tej pozycji, zaciskając w pobliżu miejsca wprowadzenia.
         ostrożność: Nie należy nadmiernie wysuwać igły, ponieważ może ona przebić ścianę wewnętrzną i utrudnić krążenie roztworów.
      5. Zwolnij zawór, aby umożliwić przepływ lodowatego roztworu PBS (200–300 ml) z powolną i stałą szybkością około 20 ml/min za pomocą pompy perfuzyjnej. Jeśli zwierzęta wymagają fiksacji zamiast ogólnej obserwacji, należy użyć tej samej dawki lodowatego 0,9% roztworu soli fizjologicznej.
      6. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj nacięcie w przedsionku, upewniając się, że roztwór stale płynie. Jeśli płyn nie przepływa swobodnie lub wypływa z nozdrzy lub pyska zwierzęcia, zmień położenie igły.
   2. Badanie przesiewowe CMH według obserwacji brutto.
      nuta: Jeżeli próbka nie jest wykorzystywana do obliczania liczby CMH na podstawie obserwacji ogólnej, etap ten można pominąć.
3. Utrwalenie
   1. Wykonaj perfuzje serca przy użyciu lodowatego 0,9% roztworu soli fizjologicznej (200-300 ml), aby oczyścić naczynia krwionośne mózgu i mózgu.
   2. Wykonaj perfuzje serca przy użyciu lodowatego 4% paraformaldehydu do utrwalenia.
   3. Odetnij głowę szczurowi, odizoluj mózg i zanurz mózg w 20% roztworze sacharozy na co najmniej 6 godzin.
   4. Zmień roztwór na 30% sacharozy i utrwalaj na kolejne 6 godzin.
4. Przygotuj skrawki tkanek mózgowych o grubości 10 mm za pomocą kriostatu.

5. Barwienie hematoksyliny i eozyny (HE)

UWAGA: Ta procedura jest wykonywana przy użyciu zestawu do barwienia HE.

1. Umyj szkiełka w wodzie destylowanej.
2. Barwieć w roztworze hematoksyliny przez 8 min. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.
3. Różnicować w 1% kwaśnym alkoholu przez 30 s. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 1 min.
4. Plamić w 0,2% wodzie amoniakalnej (niebieszczenie) lub nasyconym roztworze węglanu litu przez 30 s do 1 min. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.
5. Spłucz w 95% alkoholu (10 zanurzeń).
6. Barwienie przeciwstawne roztworem eozyny przez 30 s do 1 minuty.
7. Odwodnić przez 95% alkohol, dwie zmiany alkoholu bezwodnego, przez 5 minut każda.
8. Klarować w ksylenie przez 30 s.
9. Zamontuj metodą Liu.
10. Analiza za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego jasnego pola.
    nuta: Czerwone krwinki uwalniane z naczyń krwionośnych, które są składnikami CMH, pojawiają się w kolorze czerwono-pomarańczowym pod barwieniem HE.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lps	Sigma-Aldrich	L-2630	do indukcji stanu zapalnego
Eb	Sigma-aldrich	E2129	do wykrywania nieszczelności EB
Barwienie HE	Solarbio (Słoneczna Biologia	G1120	Zestaw do barwienia HE
Hydrat chloralu	Sigma-Aldrich	47335U	Do znieczulenia
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)	Solarbio (Słoneczna Biologia	Zobacz materiał P1022	rodzaj roztworu buforowego powszechnie stosowanego w eksperymencie
0,9% roztwór soli fizjologicznej	Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny		roztwór do perfuzji
paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127	rodzaj roztworu powszechnie stosowanego do utrwalania
20% roztwór sacharozy	Solarbio (Słoneczna Biologia	Klasa G2461	rodzaj roztworu powszechnie stosowanego do utrwalania
30% roztwór sacharozy	Solarbio (Słoneczna Biologia	Klasa G2460	rodzaj roztworu powszechnie stosowanego do utrwalania
Maść weterynaryjna	Solcoseryl żel pod oczy, Bacel, Szwajcaria		do ochrony oczu szczura

powiedział: ) powiedział: ) ) )