$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Pierwotna hodowla komórek hipokampa
- Przygotuj zdysocjowaną hodowlę komórkową hipokampa szczura w 19 dniu embrionalnym. Umieść komórki na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych pokrytych polietylenoiminą (PEI) w 24-dołkowych szalkach o gęstości 50 000 - 60 000 komórek/basenik. Sprawdź gęstość za pomocą komory zliczania komórek i optyki kontrastu fazowego.
- Hodować neurony przez 3 dni (dzień in vitro (DIV) 3) na 24-dołkowej płytce w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Oceń szkiełka nakrywkowe pod kątem wskaźników zdrowia komórek za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym (np. optyka z kontrastem fazowym przy powiększeniu 10-20x). Sprawdź następujące wskaźniki dobrego zdrowia: wyraźna aureola z kontrastem fazowym, neuryty bez struktur perełkowych oraz brak grupowania somy lub wiązki neurytów.
2. Transfekcja
UWAGA: Poniższy protokół odnosi się do podwójnej transfekcji dla 3 dołków. Jednak protokół działa najlepiej, gdy przygotowane są ilości wystarczające na 4 studnie.
- Przygotować 500 ml buforu transfekcyjnego (274 mM chlorku sodu, NaCl, 10 mM chlorku potasu, KCl, 1,4 mM wodorofosforanu disodowego, Na2HPO4, 15 mM glukozy, 42 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego, HEPES) w kolbie Erlenmeyera.
- W kolbie Erlenmeyera rozpuścić 8,0 g NaCl, 0,37 g KCl, 0,095 g Na2HPO4, 1,35 g glukozy i 5,0 g HEPES w 400 ml wody destylowanej.
- Doprowadzić pH do 6,95 za pomocą 1 M wodorotlenku sodu, NaOH za pomocą pH-metru.
- Dostosuj objętość wodą destylowaną do 500 ml i sprawdź pH za pomocą pH-metru.
- Przygotować 20 - 30 ml podwielokrotności buforu do transfekcji o następujących wartościach pH, pipetując 1 M NaOH do buforu transfekcyjnego: 6,96, 6,97, 6,98, 6,99, 7,00, 7,01, 7,02, 7,03, 7,04, 7,05, 7,06, 7,07, 7,08, 7,09, 7,11,
UWAGA: pH buforu do transfekcji ma kluczowe znaczenie dla skuteczności transfekcji.
- Aby sprawdzić, który bufor transfekcji prowadzi do największej liczby transfekowanych komórek, przetestuj każdą wartość pH od 6,96 do 7,11. Stosować metodę transfekcji opisaną w ppkt 2.2 - 2.11 oraz zwalidowany plazmid wykazujący ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP). Określ liczbę transfekowanych komórek na szkiełko nakrywkowe dla każdej wartości pH buforu transfekcji, aby ocenić, który bufor działa najlepiej.
- Porcjować bufor o najwyższej skuteczności transfekcji do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml Zamrażać i przechowywać probówki w temperaturze -20 °C.
- Podgrzej wstępnie zredukowaną pożywkę surowicy, pożywkę do hodowli komórkowych i wodę destylowaną do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
- Przygotuj mieszankę do transfekcji w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Pracuj pod okapem z przepływem laminarnym, aby zapewnić sterylne warunki pracy.
- Wymieszaj 7,5 μl 2 M chlorku wapnia z 4 μg każdego DNA wolnego od endotoksyn (Synaptophysin-mOrange i mGFP/GFP-Rogdi). Dodaj wodę do uzyskania całkowitej objętości 60 μl w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Do mieszanki dodać 60 μl buforu transfekcyjnego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, dodawaj bufor transfekcyjny kroplami, delikatnie potrząsając mieszanką DNA na wirze.
- Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut. Unikaj potrząsania rurką inkubacyjną w czasie inkubacji, umieszczając probówkę obok okapu z przepływem laminarnym.
- Pod pokrywą z przepływem laminarnym wyjąć pożywkę do hodowli komórkowych ("pożywkę kondycjonowaną") ze studzienek za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i przechowywać ją w oddzielnym pojemniku w inkubatorze.
- Dodać 500 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdego dołka. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 aż do zakończenia 20-minutowego okresu inkubacji (etap 2.3.3).
- Dodać 30 μl mieszanki do transfekcji do każdego dołka, pipetując kilka kropli. Wyrzuć pozostałość na dnie tubki.
- Po tym, jak wszystkie studzienki zostaną dostarczone z mieszanką transfekcyjną, delikatnie potrząśnij płytką 24-dołkową, aby zapewnić rozprowadzenie mieszanki transfekcyjnej w podłożu.
- Inkubować studzienki przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Wyjąć i wyrzucić mieszankę do transfekcji i przemyć ją trzykrotnie pożywką do hodowli komórkowych. Dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki i inkubować je przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Usunąć 750 μl pożywki i dodać taką samą ilość świeżej pożywki. Powtórz to trzy razy.
UWAGA: Etap prania ma kluczowe znaczenie. Utrzymuj czas, w którym w każdej studzience nie ma pożywki (tj. wyjmuj i wymieniaj dobrze po studzience) i delikatnie dodawaj pożywkę myjącą.
- Wyjąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowej i dodać 450 μl kondycjonowanej pożywki dobrze przez studzienkę.
- Pozwól neuronom dojrzeć w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do DIV 10.
3. Stymulacja i absorpcja Syt1
UWAGA: Następujący protokół stosuje pobór do 3 odwiertów. W przypadku depolaryzacji dowolnej innej liczby studzienek należy odpowiednio dostosować ilości.
- Przygotować 50 ml 10-krotnego buforu depolaryzacyjnego (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM chlorku magnezu, MgCl2, 20 mM chlorku wapnia, CaCl2, 300 mM glukozy, 200 mM HEPES, pH 7,4) w kolbie Erlenmeyera.
UWAGA: Bufor depolaryzacyjny może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Jeśli używany jest również roztwór niedepolaryzujący, przygotuj 10-krotny roztwór Tyrode'a składający się z 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glukozy, 200 mM HEPES pH 7,4 w celu porównania recyklingu wywołanego stymulacją z recyklingiem spontanicznym. Po rozcieńczeniu do 1x, przed użyciem dodać 1 μM tetrodotoksyny, aby zablokować wytwarzanie potencjału czynnościowego.
- Rozpuścić 1,87 g NaCl, 2,61 g KCl, 0,1 g MgCl2-6H 2O, 0,15 g CaCl2-2H 2O i 3,0 g glukozy-1H2O i 2,38 g HEPES w 50 ml wody destylowanej w kolbie Erlenmeyera. Dostosuj pH za pomocą NaOH i sterylnie przefiltruj roztwór. Rozcieńczyć bufor w stosunku 1:10 w wodzie destylowanej, aby uzyskać stężenie 1x.
- Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH 7,4) do utrwalenia po stymulacji.
- Na 500 ml 4% PFA w 1x PBS, rozpuść 20 g paraformaldehydu w 450 ml destylowanego H2O.
UWAGA: Podgrzanie roztworu może przyspieszyć rozpuszczanie, ale nie należy podgrzewać roztworu powyżej 70 °C, ponieważ PFA może się rozpaść.
ostrożność: PFA jest toksyczny, potencjalnie rakotwórczy i teratogenny. Podczas pracy z PFA należy nosić rękawice, pracować pod wyciągiem i unikać połknięcia.
- Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury rynkowej i dodać 50 ml roztworu podstawowego 10x PBS. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH/HCl (kwas solny) za pomocą pH-metru.
- Podgrzej 600 μl 1x buforu depolaryzacyjnego i 10 ml pożywki do hodowli komórkowych do 37 °C w łaźni wodnej.
- Dodaj 1 μl mysiego przeciwciała anty-Syt1 (klon 604.2) do 1x bufora depolaryzacyjnego i wiruj przez 10 sekund.
- Usunąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych z komórek. Dodać 200 μl mieszaniny przeciwciał depolaryzacyjnych do każdej studzienki i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
- Usuń i wyrzuć mieszaninę przeciwciał depolaryzacyjnych i przemyj ją trzykrotnie pożywką do hodowli komórkowych. Dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdego dołka i inkubować przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Usunąć 750 μl pożywki i dodać taką samą ilość świeżej pożywki. Powtórz trzy razy.
- Usuń i wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowych i dodaj 300 μl 4% PFA w 1x PBS. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Umyj trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
4. Immunocytochemia
- Przygotować 50 ml buforu blokującego.
UWAGA: Bufor blokujący może być utrzymywany w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
- Rozpuścić 2,5 g sacharozy i 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 5 ml 10 x PBS roztworu podstawowego. Dodać 1,5 ml 10% roztworu podstawowego detergentu. Mieszać roztwór, aż wszystkie składniki prawidłowo się rozpuszczą i dodawać destylowanyH2O, aż do osiągnięcia końcowej objętości 50 ml. Podwielokrotnić roztwór i zamrozić podwielokrotności do przechowywania.
- Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało sprzężone z fluoroforem (skierowane przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała Syt1) w 200 μl buforu blokującego w każdym dołku w rozcieńczeniu 1:1000.
- Usunąć i wyrzucić 1x PBS z każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe.
- Dodać 200 μl blokującej mieszaniny buforu i przeciwciała do każdego dołka i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej
ostrożność: Ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło, wszystkie kroki naprzód muszą być wykonywane w ciemności.
- Po inkubacji przemyć komórki trzy razy przez 5 minut 1 ml 1x PBS.
- Osadź szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą medium do zatapiania.
- Dodać kroplę 7 μl podłoża do zatapiania na szkiełko mikroskopowe. Usunąć szkiełko nakrywkowe z płytki 24-dołkowej, podnosząc je strzykawką i chwytając kleszczami.
ostrożność: Komórki na powierzchni szkiełka nakrywkowego łatwo ulegają uszkodzeniu, dlatego z kleszczami należy obchodzić się ostrożnie.
- Zanurz szkiełko nakrywkowe w wodzie destylowanej, aby usunąć PBS i ostrożnie wysusz, dotykając jedną krawędzią miękkiej tkanki.
- Odwróć szkiełko nakrywkowe na kroplę podłoża do zatapiania, tak aby powierzchnia zawierająca komórki była skierowana w stronę szkiełka mikroskopowego, osadzając w ten sposób komórki w podłożu zatapiającym.
- Pozostaw szkiełka do wyschnięcia pod maską na 1 - 2 godziny (przykryj je, aby uniknąć ekspozycji na światło) i przechowuj je w pudełku na szkiełka mikroskopowe w temperaturze 4 °C.
UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.