Barwienie immunologiczne neuronów traktowanych agregatami alfa-synukleiny

Streszczenie

Źródło: Panattoni, G., et al. Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do pierwotnych neuronów jako potężny model komórkowy tworzenia włókien. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje immunologiczne barwienie neuronów leczonych agregatami alfa-synukleiny (αS). Neurony są najpierw traktowane agregatami αS. Następnie są one utrwalane, przepuszczalne i traktowane roztworem blokującym. Dodaje się przeciwciała pierwszorzędowe, a następnie znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe i barwienie jądrowe. Próbka jest następnie montowana i obserwowana pod mikroskopem.

Protokół

1. Leczenie neuronów

Uwaga: Zabieg został przeprowadzony w Dywizji (DIV) 7. Wszystkie etapy są przeprowadzane pod kapturem do hodowli komórkowych w sterylnych warunkach. Przykład gęstości hodowli neuronów korowych w DIV 7 zilustrowano na rycinie 1.

1. Pula agregatów αS związanych z mikrosomami otrzymanych z rdzenia kręgowego trzech różnych chorych myszy transgenicznych w celu uzyskania roztworu 1 μg/μL, przy użyciu oryginalnego buforu homogenizacyjnego [składającego się z 250 mM sacharozy, 20 mM kwasu HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego), 10 mM KCl (chlorek potasu), 1,5 mM MgCl₂ ((chlorek magnezu), 2 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), i 1x inhibitory fosfatazy/proteazy] do rozcieńczenia.
2. Weź hodowlę neuronów na szkiełkach nakrywkowych z poli-D-lizyny w 24-dołkowych płytkach zawierających pożywkę (2% B27, 10x gentamycyna i 2 mM glutamina). Usuń 1/3 pożywki i delikatnie zastąp ją świeżą pożywką zawierającą 2% witaminy B27, 1x gentamycynę i 2 mM glutaminy.
3. Dodać 1 μg agregatów alfa-synukleiny (αS) związanych z mikrosomami do pożywki komórkowej. Przywrócić neurony do inkubatora w temperaturze 37 °C.
4. Co 3 dni przez 1 tydzień dodawać 1/3 świeżej pożywki. Nie wymieniaj nośnika. Po prostu go dodaj.
5. Po 1 tygodniu kuracji należy usunąć 1/3 pożywki i delikatnie zastąpić ją świeżą pożywką zawierającą 2% witaminy B27, 10 μg/ml gentamycyny i 2 mM glutaminy. Powtarzaj co 3 dni.
6. Napraw neurony po 2 tygodniach leczenia (DIV 21).

2. Immunofluorescencja

1. Napraw neurony za pomocą 2% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x i 5% roztworze sacharozy przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez wstrząsania pod wyciągiem chemicznym.
2. Usuń roztwór mocujący. Krótko umyć PBS 1x, 3 razy.
   nuta: Wszystkie czynności mycia należy wykonywać delikatnie, ponieważ neurony pierwotne nie przylegają mocno do szkiełek nakrywkowych z polilizyny.
3. Przepuszczalność neuronów za pomocą 0,3% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS 1x przez 5 minut w RT.
4. Krótko umyć PBS 1x, 3 razy.
5. Inkubuj neurony z 3% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w PBS 1x przez 30 minut w RT, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania na wytrząsarce orbitalnej.
6. Inkubować neurony z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym rozpuszczonym w 3% FBS w PBS 1x, O/N w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej.
   UWAGA: zastosowano przeciwciała syn303 (1:1,000), mysie αS (1:200), pser129-αS (1:1,000) i Tau (1:10,000).
7. Usunąć roztwór przeciwciał i krótko przemyć PBS 1x, 3 razy.
8. Inkubować neurony z odpowiednim fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym rozpuszczonym w 3% FBS w PBS przez 1 godzinę w RT w ciemności na wytrząsarce orbitalnej.
9. Usunąć roztwór przeciwciał i krótko przemyć PBS 1x, 3 razy.
10. Barwić neurony roztworem DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindolu) (0,1 μg / ml w PBS 1x) przez 15 minut w RT w ciemności na wytrząsarce orbitalnej.
11. Usunąć roztwór przeciwciał i krótko przemyć PBS 1x, 3 razy.
12. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.

Wyniki

Rysunek 1. Hodowle neuronów korowych. Reprezentatywny obraz przedstawiający gęstość w DIV 7 kultur neuronów korowych. Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu z odwróconym światłem, obiektywu 10X. Podziałka = 100 μm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
sacharoza	Sigma-Aldrich	84097-1KG
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887-100ML	1M pH = 7-7,6
Edta	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH=8 0,5 M
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M8266-100G
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	S7795-500G
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761-500G
metanol	Sigma-Aldrich	Nr kat. 322415-6X1L
Kcl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P9541-500G
cOmplete Mini	Roche	11836170001	inhibitor proteazy
Detektor PhosStop	Roche	4906837001	Inhibitor fosfatazy
Zestaw do oznaczania białek BCA	Euroklon	EMPO14500
Criterion TGX 4-20% Bez plam, 18 dołków	Biorad	5678094
Obsługiwana membrana nitrocelulozowa	Biorad	1620097	0,2 μm
Bloker klasy blottingowej	Biorad	1706404	Odtłuszczone mleko w proszku
Podłoże chemiluminescencyjne SuperSignal West Pico	Termo Fisher Scientific	Numer katalogowy: 34077
kwas azotowy	Sigma-Aldrich	1004411000	65%
Szkiełka nakrywkowe szklane	Termo Fisher Scientific	Numer katalogowy 1014355118NR1	18 mm x
Poli-D-lizyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7280
Zbilansowany roztwór soli Hanka	Termo Fisher Scientific	14170-500 ml
Penicylina/Streptomycyna	Termo Fisher Scientific	15140122	10 000 U/ml, 100 ml
Zmodyfikowany Medium Orła Dulbecco	Termo Fisher Scientific	D5796-500 ml
Trypsyna-EDTA	Termo Fisher Scientific	15400054	0,50%
Suplement B27	Termo Fisher Scientific	17504044	50-krotny
Glutamax (Glutamax)	Termo Fisher Scientific	Nr kat. 35050-038	100x
DNAzy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D5025
Surowica bydlęca płodu	Euroklon	EC50182L
Glutaminianu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 1446600-1G
Gentamycyna	Termo Fisher Scientific	Numer katalogowy: 15710	10 mg/ml
Podłoże nerwowo-podstawowe	Termo Fisher Scientific	Numer katalogowy 10888-022
Arabinozyd cytozyny (AraC)	Sigma-Aldrich	C3350000
Środek montażowy VECTASHIELD antifade	Laboratoria wektorowe	H-1000
DAPI (interfejs DAPI)	Termo Fisher Scientific	Numer katalogowy: 62247
Wirnik 90 Ti	Beckman	N/a	Wirnik ultrawirówkowy
Ultrawirówka Optima L-90K	Beckman	N/a
Przeciwciało Syn-1, klon 42	BD Nauki biologiczne	610786	WB przeciwko myszy: 1:5000
Przeciwciało Syn303	Legenda biologiczna	824301	anty-mysz JEŻELI: 1:1000
Przeciwciało Tau	Układy synaptyczne	314 002	anty-królik JEŻELI: 1:10 000
Przeciwciało pser129-αS	Dar od Fujiwary i wsp., odniesienie 19		WB anty-królika: 1:5000
Przeciwciało pser129-αS	Księga Abcam	ab51253	anty-królik IF: 1:1000
Mysz αS (D37A6) XP	Sygnalizacja komórkowa	Numer katalogowy 4179	anty-królik IF 1:200
Przeciwciało anty-królicze sprzężone z Alexa fluor 555	Termo Fisher Scientific	Nr kat. A27039
Przeciwciało anty-mysie sprzężone z fluorem 488 Alexa	Termo Fisher Scientific	A-11029
Mikroson XL-2000	Misonix (Język misonix		Sonifikacji
Butelki Ultra (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Montaż, Nakrętka Noryl, typu Beckman	Służba Naukowa UE	Zobacz materiał S4484	Probówki ultrawirówkowe
AXIO Observer Mikroskop Światła Odwróconego	Zeiss	N/a
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny TCS SP2	Księga Leica	N/a
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny	Nikon	N/a
Tryton x-100	Sigma-Aldrich	Pojemność 100-500 ml	Niejonowy środek powierzchniowo czynny

wzrost szt. powiedział: TGL )