Model in vitro uszkodzeń rozciągających w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych

Streszczenie

Źródło: Phillips, J. K. et al. Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje proces wywoływania uszkodzeń rozciągających na ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych (hiPSCN). Komórki są pobierane na bezdennej płytce wielodołkowej z dołączoną membraną silikonową. Kontrolowane naprężenia mechaniczne są wywierane na błonę w celu wywołania rozerwania cytoszkieletu i uszkodzenia błony komórkowej, indukując fenotyp uszkodzenia rozciągającego w komórkach.

Protokół

1. Produkcja płyt

1. Poddaj plazmowo 96-dołkową płytkę za pomocą środka do czyszczenia plazmowego o mocy 200 W (patrz Tabela materiałów) przez 60 sekund przy dużej mocy, umieszczając ją od dołu do góry wewnątrz myjki plazmowej. Sprawdź, czy przez okno komory widoczna jest fioletowa poświata, która wskazuje, że uformowała się efektywna plazma. Ta technika łączenia została zaadaptowana z Sunkara i wsp.
2. W ciągu 60 s umieść górną część płytki w 200 ml 1,5% (3-aminopropylo)trietoksysilanu (APTES) w wodzie dejonizowanej (DI) na 20 minut, dnem do dołu. To rozwiązanie jest niestabilne: przygotuj je nie później niż 60 s przed wprowadzeniem płytki.
   ostrożność: Praca z APTES w dygestorium.
3. Plazma traktuje wyekstrahowaną membranę silikonową w czyszczalni plazmowej przez 60 s z dużą mocą. Obróbkę plazmową należy ustawić w czasie tak, aby zakończyła się nie później niż 5 minut przed końcem okresu 20 minut opisanego w kroku 1.2.
4. Użyj kleszczyków, aby umieścić błonę potraktowaną plazmą na prostokącie z pergaminu o wymiarach 7.5 x 11 cm². Wyrównaj aluminiową płytę o wymiarach 7.5 cm x 11 cm x 0.5 cm na dolnej części zacisku do produkcji płyty. Wyrównaj membranę silikonową i pergamin na płycie aluminiowej za pomocą kleszczy.
5. Zdejmij wierzchołki płytek z kąpieli APTES i strząśnij nadmiar roztworu. Zanurz się w 200 ml łaźni wodnej DI na 5 sekund i strząśnij nadmiar wody. Zanurz się w innej kąpieli wodnej o pojemności 200 ml DI na 5 sekund i strząśnij nadmiar wody. Wymień wodę w tych wannach przed zanurzeniem kolejnej płytki.
6. Użyj sprężonego powietrza, aby całkowicie wysuszyć górną część płyty.
7. Umieść górną część płyty w górnej części zacisku do produkcji płyty. Delikatnie zamknij zacisk do produkcji płyty, aby docisnąć do siebie górną część płyty i silikon. Clamp przez co najmniej 1 godzinę.
8. Przed użyciem pozostawić płytkę do utwardzenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, chronić przed kurzem.

2. Rozciąganie talerza

1. Wyczyść wgłębniki
   1. Przygotuj sonikator o mocy 60 W w stylu kąpielowym z wodą DI o temperaturze pokojowej.
   2. Podeprzeć blok wgłębnika nad wanną sonikatora, odwrócony tak, aby tylko wierzchołki wgłębników były zanurzone na głębokość co najmniej 1 mm. Sonduj wgłębniki przez 8 minut przy częstotliwości 42 kHz.
   3. Wysuszyć wgłębniki sprężonym powietrzem.
2. Wyrównaj blok wgłębnika
   1. Ustaw kamerę z przekazem na żywo nad urządzeniem rozciągającym tak, aby patrzyła w dół na matrycę wgłębnika. Skoncentruj się na górnej części wgłębień.
      nuta: Konfiguracja opisana w Sekcji 3, "Charakterystyka rozciągania membrany", jest jedną z możliwych konfiguracji kamery do tego zadania.
   2. Przymocuj płytkę na scenie urządzenia do zranienia za pomocą stage clamps (Rysunek 1) i umieść lampę kopułkową nad urządzeniem.
      nuta: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z oprogramowaniem sterującym przyrządem.
   3. Uruchom oprogramowanie do sterowania instrumentem, klikając ikonę oprogramowania na pulpicie komputera, który steruje urządzeniem do urazu. Uruchom projekt "in_vitro_neurotrauma.lvproj", klikając go w oknie uruchamiania. W oknie projektu uruchom wirtualne instrumenty sterowania ruchem i śledzenia pozycji (VI), które są nazwane odpowiednio "motion_control.vi" i "position_tracker.vi", klikając je dwukrotnie.
   4. Zamknij klatkę otaczającą urządzenie do urazów. Naciśnij przycisk "strzałki" w lewym górnym rogu sterownika ruchu VI, aby uruchomić VI i kliknij "Blisko dołu", aby obniżyć stolik z dokładnością do 2 mm od zetknięcia się z wgłębnikami. Kliknij przycisk "Stop", aby zatrzymać VI.
      ostrożność: Trzymaj ręce z dala od noszy podczas manipulowania kamerą w klatce. Klatka powinna być wyposażona w wyłącznik drzwiowy, który dostarcza moc do urządzenia rozciągającego tylko wtedy, gdy drzwi klatki są zamknięte.
   5. W oknie projektu kliknij prawym przyciskiem myszy na "Oś 1". Kliknij "Interaktywny panel testowy". W oknie, które zostanie otwarte, ustaw rozmiar kroku na 50 μm, wpisując "500" jednostek w polu "Pozycja docelowa".
   6. Kliknij kilkakrotnie zielony przycisk "Przejdź" u dołu okna "Interaktywny panel testowy", aż tabliczka po raz pierwszy zetknie się z jakimikolwiek wgłębieniami. Sprawdź, czy na obrazie na żywo wyświetlanym przez kamerę nie ma kontaktu. Zwróć uwagę na pionową pozycję stołu montażowego podaną w lewym górnym rogu okna "Interaktywny panel testowy"; To jest pierwsza pozycja kontaktowa.
   7. Obniżać się dalej (jak opisano w kroku 2.2.6), aż każda studzienka zetknie się z wgłębnikami. W razie potrzeby przesuń kamerę, aby zobaczyć całą płytę i przesuń stolik w górę (określając ujemną "pozycję docelową") i w dół. Zwróć uwagę na pionową pozycję stołu montażowego podawaną w lewym górnym rogu okna, gdy wszystkie słupki są ze sobą w kontakcie (jest to pełna pozycja styku).
   8. Zwróć uwagę na różnicę między pozycją pierwszego kontaktu a pozycją pełnego kontaktu. Zamknij "Interaktywny panel testowy". Uruchom "sterowanie ruchem VI" (patrz krok 2.2.4) i kliknij "Góra", aby podnieść scenę. Zatrzymaj sterowanie ruchem VI za pomocą przycisku "Stop".
   9. Gdy stolik znajdzie się na szczycie swojego skoku, otwórz drzwiczki, aby dezaktywować urządzenie. Wyreguluj dociskowe w rogach bloku wgłębnika. Poluzuj ustalającą na rogu, który zetknął się jako pierwszy, aby ją opuścić i dokręć przeciwległą, aby podnieść róg, który zetknął się jako ostatni.
   10. Powtórz proces opuszczania stolika, aż płytka zetknie się z wgłębnikami, sprawdzając obrazy styków pod kątem nachylenia, podnosząc stolik i regulując (krok 2.2.9) blok wgłębnika. Gdy stolik i blok są wyrównane, wszystkie wgłębniki zetkną się jednocześnie.
   11. Otwórz drzwi, aby dezaktywować urządzenie. Włóż mocujące do ich otworów w bloku wgłębnika i dokręć je. Upewnij się, że blok jest wypoziomowany ze mocującymi na miejscu (kroki 2.2.4-2.2.8). Zwróć uwagę na pozycję stolika podawaną przez "Interaktywny panel testowy" w momencie zetknięcia się płytki. Będzie to pozycja zerowa dla eksperymentów z wcięciami.
3. Nasmarować wgłębniki
   1. Jeśli blok wgłębnika został właśnie ustawiony i nie został jeszcze nasmarowany, wyczyść solidną gumową podkładkę (7.5 cm x 11 cm x 1.5 mm) i miękką podkładkę z pianki piankowej o zamkniętych komórkach (7.5 cm x 11 cm x 3 mm) chusteczką laboratoryjną nasączoną etanolem. Pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu.
   2. Namocz chusteczkę laboratoryjną w oleju kukurydzianym i rozprowadź ją na solidnej gumowej podkładce, aby uzyskać matowy połysk.
   3. Umieść podkładkę piankową na podkładce z litej gumy, aby przenieść olej do podkładki piankowej. Umieść aluminiową płytę o wymiarach 7.5 cm x 11 cm x 0.5 cm na wierzchu podkładki piankowej i załaduj ją balastem o wadze około 360 g (np. 6 stożkowych rurek załadowanych 45 ml wody każda), aby zapewnić równomierny transfer oleju z solidnej gumowej podkładki do podkładki piankowej. Odczekaj 10 sekund, aż olej przeniesie się na podkładkę z gumy piankowej.
   4. Przesuń podkładkę z gumy piankowej na matrycę wgłębnika. Umieść na niej aluminiową płytę i obciążnik balastowy, aby zapewnić równomierny transfer oleju do końcówek wgłębników. Odczekaj 10 sekund, aż olej przeniesie się do wgłębień.
   5. Jeżeli żadna płytka nie została rozciągnięta od czasu ustawienia i nasmarowania bloku wgłębnika po raz pierwszy, należy rozciągnąć płytkę testową przed rozpoczęciem doświadczenia. Uwaga: Zapobiegnie to zakłóceniom eksperymentu wynikającym z niespójności między pierwszym odcinkiem a kolejnymi odcinkami. W przypadku kolejnych odcinków powtórz tylko kroki 2.3.2-2.3.5 przed każdym odcinkiem.
4. Rozciąganie talerza
   1. Nasmarować wgłębniki zgodnie z opisem w kroku 2.3.
   2. Przymocuj płytkę na stoliku urządzenia do zranienia za pomocą stage clamps. Jeśli wymagana jest sterylność, wyreguluj położenie pokrywy, aby zabezpieczyć płytkę bez wystawiania powierzchni hodowli na działanie powietrza w pomieszczeniu.
   3. Obniżyć stolik do pozycji zerowej za pomocą "sterowania ruchem VI" (patrz kroki 2.2.4-2.2.6); położenie zerowe określa się w kroku 2.2.
   4. Zmień nazwę pliku w polu "ścieżka pliku" w "śledzenie pozycji VI" na unikalną nazwę pliku, a następnie uruchom go za pomocą przycisku "strzałka" w lewym górnym rogu tego okna.
   5. Ustaw głębokość i czas trwania wcięcia (zwykle odpowiednio 1-4 mm i 30 ms, maksymalna głębokość 5 mm, minimalny czas trwania 15 ms) w polach "Uraz (mm)" i "Czas trwania urazu (ms)" w "panelu sterowania ruchem VI", klikając pola i wpisując żądane wartości.
   6. Uruchom "panel sterowania ruchem VI" i kliknij "Zranij", aby wciąć płytę.
   7. Przesuń etap na szczyt jego skoku, klikając na "Góra". Następnie zatrzymaj VI przyciskiem "Stop" i dezaktywuj urządzenie do urazu, otwierając drzwi.
   8. Należy sprawdzić przebieg przemieszczenia stopnia przedstawiony w "urządzeniu śledzącym położenie VI", aby potwierdzić, że zastosowano określone maksymalne przemieszczenie. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres i kliknij "eksportuj do Excela". Kliknij "Plik| Zapisz", aby zapisać dane.

3. Charakterystyka rozciągania membrany

1. Pomaluj wgłębienie w górnej części każdego wgłębnika na biało, aby zapewnić tło o wysokim kontraście do szybkiego filmowania. Uwaga: Nie malować felg wgłębników w miejscach, w których stykają się z płytkami.
2. Drukuj 3D z poli(kwasu mlekowego) (PLA) lub w inny sposób wyprodukuj cylindryczny stempel, za pomocą którego zrobisz kropkę w każdym dołku. Spraw, aby cylinder miał średnicę 5.9 mm i wysokość 12.2 mm, z cylindrycznym występem o średnicy 1.5 mm i wysokości 1.0 mm wyśrodkowanym na górze.
3. Plazma traktuje płytkę prawą stroną do góry, aby aktywować powierzchnię hodowli komórek silikonowych w studzienkach przez 60 s, jak wspomniano w kroku 2.1.
4. Umieść płytkę na gumowej podkładce lub innej miękkiej powierzchni. Mały występ na stemplu należy zagruntować (patrz krok 1.2) tuszem z markera permanentnego. Włóż stempel do studzienki, która ma być testowana, i postukaj, aby zapewnić dobry transfer atramentu. Zagruntuj stempel przed każdym dołkiem.
5. Wyrównaj blok wgłębnika i nasmaruj wgłębniki urządzenia do uszkadzania (patrz kroki 2.2-2.3). Clamp płytkę na stoliku urządzenia do urazu. Umieść jasne, rozproszone światło osiowe nad urządzeniem do urazu.
6. Ustaw szybką kamerę na stojaku na wysięgniku nad urządzeniem do urazu, skierowaną prosto w dół, z obiektywem ustawionym na najmniejszy ponumerowany przysłon i włącz ją. Uruchom oprogramowanie aparatu na komputerze podłączonym do aparatu. Z menu rozwijanego liczby klatek na sekundę wybierz 2,000 klatek na sekundę, a następnie z menu rozwijanego migawki wybierz najszybszy czas ekspozycji, który daje obrazy o wysokim kontraście. Wyśrodkuj nad kropkowanymi studniami.
   1. Ustaw kamerę tak, aby pole widzenia zawierało 12 studzienek w siatce 3 x 4.
      nuta: To pole widzenia zapewnia optymalny kompromis między przepustowością a rozdzielczością dla obrazu o rozdzielczości 1 280 × 1 024.
7. Opuścić płytkę do punktu zerowego (patrz kroki 2.2.4-2.2.6). Kliknij jednym kliknięciem przycisk nagrywania w oprogramowaniu aparatu, aby wyświetlić komunikat "wyzwól". Uruchomić urządzenie śledzące położenie VI (krok 2.4.4).
8. Włącz jasne, rozproszone światło osiowe. Wciąć tabliczkę zgodnie z opisem w kroku 2.4.6.
9. Wyłącz jasne, rozproszone światło osiowe.
10. Na komputerze sterującym kamerą znajdź okno 30-40 ms nagrania, w którym występuje wcięcie: przeciągnij strzałki początku i końca na pasku szybkiego odtwarzania wideo w oprogramowaniu aparatu. Kliknij Zapisz, ustaw nazwę w polu "Nazwa pliku", wybierz "TIFF" w polu "Format" i kliknij "Zapisz".
    1. Spójrz przez . Pliki TIF-a dla obrazów o stanie najmniej rozciągniętym (początkowym) i najbardziej rozciągniętym (wcięcie szczytowe).
    2. Aby zmierzyć wysokość i szerokość kropek na obu obrazach, użyj Fidżi, aby otworzyć obrazy najmniejszego i szczytowego rozciągnięcia obok siebie. Korzystając z domyślnego narzędzia do zaznaczania prostokątnego, kliknij i przeciągnij, aby narysować ramkę wokół kropki na obrazie o najmniejszym rozciągnięciu. Zmierz wysokość i szerokość za pomocą opcji "Analizuj| Środek".
    3. Powtórz te czynności dla kropki w tym samym dołku na obrazie rozciągnięcia szczytowego. Powtórz dla pozostałych dołków.
11. Oblicz odkształcenie Lagrange'a w kierunkach x i y w następujący sposób:
    
    nuta: Tutaj E_xx jest szczepem Lagrange'a w kierunku x, E_yy jest szczepem Lagrange'a w kierunku y, X jest szerokością kropki, Y jest wysokością kropki, _f oznacza końcowy obraz (tj. obraz wcięcia szczytowego), a _i oznacza obraz początkowy (tj. obraz przed wcięciem). Uśrednij te dwie wartości, aby określić odkształcenie w tej studni.

4. Posiewanie hodowanych komórek

1. Autoklaw pojemników i obciążników balastowych, które będą używane do sterylizacji.
2. Płytki z silikonowym dnem należy traktować plazmowo prawą stroną do góry przez 60 s (patrz krok 1.1). Natychmiast zanurz płytki w sterylnych pojemnikach zawierających 70% etanolu na 15 minut.
3. Zanurz płytki w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w oddzielnych sterylnych pojemnikach na 30 minut.
4. Odessać PBS ze studzienek. Suszyć tylko jedną płytkę na raz, aby zapobiec utracie obróbki plazmowej przez studzienki.
   ostrożność: Płytki z silikonowym dnem zapewniają mniej wyczuwalne sprzężenie zwrotne podczas pipetowania niż sztywne płytki i częściej blokują końcówkę pipety.
5. Do wysterylizowanych płytek dodać 100 μl 0,1 mg/ml poli-L-ornityny (PLO) na studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
6. Przepłukać studzienki dwukrotnie sterylnym PBS o pojemności 100 μl, pozostawiając drugie płukanie na studzienkach, aż zawiesina komórek będzie gotowa.
7. Wyjąć fiolkę z hiPSCN z magazynu ciekłego azotu za pomocą rękawic ochronnych i umieścić na suchym lodzie. Szybko przetransportować fiolkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i rozmrażać dokładnie przez 3 minuty. Nie obracać fiolki.
8. W sterylnym kapturze delikatnie przenieść zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 1 ml.
9. Przepłukać pustą fiolkę kriogeniczną 1 ml pożywki do konserwacji o temperaturze pokojowej (podłoże, baza + suplement).
10. Przenieś 1 ml pożywki do probówki o pojemności 50 ml kroplami w tempie około jednej kropli na sekundę. Delikatnie obracaj rurką podczas dodawania. Dodaj 8 ml pożywki do konserwacji o temperaturze pokojowej do probówki o pojemności 50 ml w ilości około 2 kropli/s.
11. Zakryj rurkę i odwróć 2-3 razy. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Oblicz objętość dodatkowego podłoża wymaganego do rozcieńczenia zawiesiny komórek do 225 000 komórek/ml.
12. Delikatnie odpipetować ilość pożywki (obliczoną powyżej) do probówki z zawiesiną komórek za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml.
13. Dodać 10 μl lakininy o stężeniu 1 mg/ml na 1 ml zawiesiny komórek za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać 10 μg/ml lamininy w zawiesinie komórek. Zassaj raz w górę iw dół końcówką używaną do lamininy, a następnie zakryj rurkę i raz odwróć rurkę.
14. Odsysać PBS z płytek, po jednej płytce na raz. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μl zawiesiny komórek hiPSCN do każdego dołka. Studzienki mają powierzchnię hodowli 0,33 cm², więc gęstość komórek na powierzchnię wynosi 67 500 komórek/cm².
15. Odpocznij talerze w temperaturze pokojowej przez 15 minut po wysianiu, aby ułatwić przyczepienie. Aby uniknąć wibracji wentylatora sterylnego okapu hodowlanego, umieść zakryte płytki na stole laboratoryjnym. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
16. Przeprowadzić pełną wymianę pożywki po 24 godzinach, napełniając studzienki 200 μl kompletnego podłoża konserwacyjnego. Wykonuj połówkową wymianę podłoża w ilości 100 μl/studzienkę co 2-3 dni.

5. Krzywdzenie kultur

1. Wyrównaj blok wgłębnika i znajdź pozycję zerową zgodnie z opisem w kroku 2.2. Nasmarować wgłębniki zgodnie z opisem w kroku 2.3.
2. Ustaw nazwę pliku dla historii przemieszczeń w 'position tracker VI' (krok 2.4.4). Ustaw parametry obrażeń w "Motion Control VI" (krok 2.4.5).
3. Wyjmij płytkę, która ma zostać uszkodzona, z inkubatora i zaciśnij ją na scenie. Dostosuj położenie pokrywy, aby zabezpieczyć płytkę bez wystawiania kultur na działanie powietrza w pomieszczeniu.
4. Opuścić tabliczkę do punktu zerowego (kroki 2.2.4-2.2.6) za pomocą "sterownika ruchu VI". Uruchomić "Position Tracker VI" (krok 2.4.4).
5. Użyj regulatora ruchu VI, aby wciąć płytkę (zgodnie z opisem w kroku 2.4.6). W przypadku odcinków pozorowanych pomiń tylko ten krok.
6. Przywróć stolik do górnej granicy jego zakresu ruchu (patrz krok 2.4.7). Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
7. Sprawdź i zapisz ślad przemieszczenia (jak w kroku 2.4.8).

Wyniki

Rysunek 1: Oznakowany schemat urządzenia do urazu.(A) Widok z góry, (B) widok izometryczny, (C) widok z przodu, (D) widok z prawej strony. Podziałka liniowa ma zastosowanie do widoków prostopadłych (A, B i D).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
.010" Arkusz silikonowy	Produkcja specjalistyczna, Inc	#70P001200010	Arkusz polidimetylosiloksanu (PDMS)
Iskrale (Sparkleen)	Fisher Naukowy	#043204
Nunc 256665	Fisher Naukowy	#12-565-600	Bezdenna płyta 96-dołkowa
Chusteczki Kim	ULINE (ULINE)	S-8115
Czyścik plazmowy	Plazma Harricka	#PDC-001-HC
(3-aminopropylo)trietoksysilan	Sigma-Aldrich	#440140	APTES (APTES)
Papier pergaminowy	Reynolds	N/a
Oświetlenie kopuły	CCS inc	LFX2-100SW
Zasilanie światła kopuły	CCS inc	PSB-1024VB
Osiowa jednostka oświetlenia dyfuzyjnego	simens	Nerlite DOAL-75-LED	Rozproszone światło osiowe
Matryca LED dużej mocy	Cree	XLamp CXA2540	Matryca LED dużej mocy
Oprawka LED	Molex	1807200001	Uchwyt LED
Zasilacz LED	Średnia wartość	HLG-320H-36B	Zasilacz stałoprądowy
Oprogramowanie FastCam Viewer	Fototron		Aparat fotograficzny softeware
Szybka kamera Mini UX50	Fototron	N/a	Szybka kamera
Obiektyw Micro-NIKKOR 105mm f/2.8	Nikon	#1455	Obiektyw do szybkiej kamery
0,1 mg/ml poli-L-ornityny	Sigma-Aldrich	#P4597
Komórki iCell	Międzynarodowa Dynamika Komórkowa	#NRC-100-010-001
Nośniki iCell	Międzynarodowa Dynamika Komórkowa	#NRM-100-121-001
Suplement iCell	Międzynarodowa Dynamika Komórkowa	#NRM-100-031-001
Laminina	Sigma-Aldrich	#L2020
Siłownik cewki drgającej	BEI Kimco	LA43-67-000A
Optyczny enkoder liniowy	Firma Renishaw	T1031-30A
Serwonapęd	Sterowanie Copley	Xenus XTL
kontroler	Instrumenty krajowe	cRIO 9024 Kontroler PowerPC w czasie rzeczywistym
Podwozie cRIO	Instrumenty krajowe	cRIO 9113
cyfrowy moduł wejściowy	Instrumenty krajowe	NI 9411
Obudowa do pozyskiwania danych	Instrumenty krajowe	NI 9113
Widok LabVIEW	Instrumenty krajowe
Sieci hiPSCN	Międzynarodowa Dynamika Komórkowa

powiedział: