$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zwierzęta
- Utrzymuj szczep TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebry 167 (AB) w wieku od 6 do 9 miesięcy w standardowych warunkach w wodzie o temperaturze 26,5 °C i cyklu 14/10 godzin światła/ciemności.
2. Odwracalne znieczulenie ogólnoustrojowe
- Przygotować roztwór podstawowy soli metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (trikainy), rozpuszczając 400 mg proszku trikainy w 97,9 ml wody w zbiorniku i 2,1 ml 1 M soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS). Doprowadzić do pH 7,0 za pomocą 1 M Tris (pH 9) i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do jednego miesiąca.
nuta: Trikaina powinna być przygotowywana w wodzie, tak jak naturalne warunki życia zwierzęcia, najlepiej należy używać oryginalnej wody ze zbiornika.
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy w stosunku 1:25 w wodzie w zbiorniku i natychmiast zużyć.
- Umieść danio pręgowanego na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej 50 ml roztworu znieczulającego, aż staną się nieruchome i nie będą reagować na bodźce zewnętrzne (około 2 - 5 minut, w zależności od wagi i wieku).
- Przenieś każdą rybę ręcznie do specjalnie wykonanego silikonowego uchwytu na szpilki do obróbki laserowej (Rysunek 1A).
ostrożność! Ryby mogą pozostać znieczulone na zewnątrz zbiornika tylko do 10 minut.
- Aby odwrócić znieczulenie po zabiegu i/lub obrazowaniu, umieść danio pręgowanego w pojemniku zawierającym wodę w zbiorniku.
- Aby wspomóc regenerację, stwórz przepływ świeżej wody w zbiorniku przez skrzela, przesuwając danio pręgowanego w przód iw tył w wodzie.
3. Laserowe uszkodzenie ogniskowe siatkówki
UWAGA: Laser diodowy o długości fali 532 nm jest używany do tworzenia ogniskowych uszkodzeń świetlnych na siatkówce danio pręgowanego. Eksperymentalna konfiguracja lasera umożliwia ustalenie powtarzalnego ogniskowego uszkodzenia siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych.
- Ustaw moc wyjściową lasera: 70 mW; średnica anteny: 50 μm; czas trwania impulsu: 100 ms.
ostrożność! Stosowanie światła laserowego wymaga odpowiedniego zabezpieczenia osobistego i oznakowania terenu.
- Przed zabiegiem nanieść miejscowo 1 - 2 krople 2% hydroksypropylometylocelulozy do oka i użyć soczewki lasera do dna oka o średnicy 2,0 mm, aby skupić wiązkę celującą laserem na siatkówce.
ostrożność! Krople hydroksypropylometylocelulozy są lepkie i mogą powodować problemy z oddychaniem, jeśli dostanie się na skrzela.
- Umieść cztery plamki laserowe wokół nerwu wzrokowego na lewym oku i użyj prawego, nieleczonego oka jako kontroli wewnętrznej.
