Pomiar aktywacji receptora zapachowego za pomocą cyklicznego testu monofosforanu adenozyny w czasie rzeczywistym

Streszczenie

Źródło: Zhang, Y. et al., Pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym. J. Vis. Exp.(2017)

Ten film demonstruje protokół pomiaru aktywacji receptora zapachowego w transfekowanych komórkach za pomocą cyklicznego biosensora adenozynomonofosforanu (cAMP) i detekcji luminescencji. Metoda ta jest stosowana do badania interakcji receptor-ligand i szlaków sygnałowych w neuronach węchowych.

Protokół

1. Stymulacja i pomiar aktywności receptora zapachowego (OR) za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym

1. Obserwuj transfekowane komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić prawidłowe zbieganie 50-80% na studzienkę i wróć do inkubatora.
2. Przygotuj pożywkę stymulującą, dodając 10 mM kwasu hydroksyetylopiperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 5 mM glukozy do zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS).
3. Rozmrozić podwielokrotności odczynnika substratowego do testu cAMP w czasie rzeczywistym na lodzie. Odczynnik substratowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C w temperaturze 55 μl na probówkę w probówkach do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Użyj 1 probówki na talerz.
4. Przygotować 2% roztwór równoważący, mieszając 55 μl odczynnika substratowego i 2750 μL HBSS/HEPES/roztworu glukozy.
5. Rozłóż grubą warstwę ręczników papierowych na ławce. Delikatnie i wielokrotnie postukaj płytką do góry nogami w ręcznik papierowy, aby medium transfekcyjne zostało przez nią całkowicie wchłonięte.
6. Przemyć komórki, pipetując 50 μl roztworu HBSS/HEPES/glukozy do każdego dołka.
7. Delikatnie i wielokrotnie wystukiwać roztwór HBSS/HEPES/glukozy z płytki 96-dołkowej.
8. Odpipetować pipetą 25 μl 2% roztworu równoważącego do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 2 godziny.
9. Przygotować zawczasu 1 M roztwory podstawowe środka nawaniającego w dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
10. Przed zakończeniem czasu inkubacji rozcieńczyć roztwory podstawowe środka zapachowego do stężeń roboczych w pożywce do stymulacji HBSS/HEPES/glukozy.
    nuta: Stężenia rozcieńczeń nawaniaczy przygotowanych na tym etapie należy podwoić, aby uzyskać prawidłowe stężenia końcowe w każdym studzience.
11. Za pomocą chemiluminescencyjnego czytnika płytek i przed dodaniem środka zapachowego zmierz podstawowy poziom luminescencji płytki 2 razy z rzędu z szybkością 1000 ms na studzienkę.
12. Szybko wyjmij płytkę z czytnika płytek, dodaj 25 μl rozcieńczeń nawaniacza do każdej studzienki i natychmiast rozpocznij ciągły pomiar luminescencji wszystkich studzienek przez 20 cykli w ciągu 30 min.
    nuta: Pipetować ostrożnie, aby uniknąć zanieczyszczenia sąsiednich studzienek w przypadku stosowania różnych substancji zapachowych i/lub różnych stężeń tych samych substancji zapachowych na tej samej płytce.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dmso	Sigma	Zobacz materiał D2650
Odczynnik GloSensor cAMP	Preparat Promega	E1290
HBSS, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	14175095
HEPESY	Klon	SH30237
Stożek	Santa Cruz	SC-200528
Piżmo tybetenowe	Sigma-Aldrich	S359165
PBS, bez wapnia i magnezu	Komórka	21-040-CV
0,2 ml probówki do PCR	Axygen (Axigen	PCR-02-C
Probówka Eppendorfa 1,5 ml	Eppendorf
Rurka stożkowa 15 ml 17 mm x 120 mm	BD Sokół	352096
Pipetownik wielokanałowy 8-dołkowy i/lub 12-dołkowy	Eppendorf
96-dołkowa płaskodenna płytka do hodowli białych krwinek	Greiner	655098
Naczynie do hodowli komórkowych 100 mm x 20 mm	BD Sokół	353003
Nieskończony czytnik płytek F200	Tecan (tekan)