Charakterystyka przestrzeni zewnątrzkomórkowej w wycinku mózgu za pomocą mikroelektrod jonoselektywnych i jonoforetycznych

Abstract

Źródło: Odackal, J., et al. Jonoforeza w czasie rzeczywistym z tetrametyloamonią w celu ilościowego określenia objętości, frakcji i krętości przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje, jak scharakteryzować przestrzeń zewnątrzkomórkową w wycinku mózgu za pomocą mikroelektrod jonoselektywnych i jonoforetycznych do pomiaru i porównywania sygnałów elektrycznych. Proces ten pomaga określić objętość, frakcję przestrzeni i stopień skręcenia.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Jonoforeza w czasie rzeczywistym w wycinkach mózgu

1. Umieść wycinek mózgu o grubości 400 μm w komorze nagrywającej, upewniając się, że jest całkowicie zanurzony w przepływającym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF). Ułóż plasterek za pomocą pędzla akwarelowego i delikatnie zabezpiecz go siatką.
2. Przesuń zarówno mikroelektrodę jonoforezy, jak i ISM powyżej pola zainteresowania na wycinku mózgu. Zanurz się zarówno w płynącym ACSF, ale powyżej plasterka.
3. Zrównoważ napięcie zarówno dla kanału odniesienia, jak i kanału wykrywania jonów do "0" mV. Poczekaj, aż napięcie w obu kanałach się ustabilizuje. Na rejestratorze wykresów zaznacz napięcie zmierzone na kanale wykrywania jonów ISM. Użyj tego, aby obliczyć parametr linii bazowej V w Wanda.
4. Umieść mikroelektrodę ISM i mikroelektrodę jonoforetyczną na głębokości 200 μm w plastrze i w odległości 120 μm od siebie. Poczekaj na ustabilizowanie się sygnału po przeniesieniu mikroelektrody do wycinka mózgu.
   nuta: Prąd polaryzacji przyłożony do mikroelektrody jonoforezy powoduje niewielkie nagromadzenie tetrametyloamonu (TMA). Częstym błędem jest zbyt wczesne nagrywanie i niedocenianie narastania sygnału.
5. Na rejestratorze wykresów zaznacz ustabilizowane napięcie zmierzone w wycinku mózgu na kanale wykrywania jonów ISM. Oblicz różnicę napięcia między sygnałem TMA zmierzonym w kroku 8.3 a krokiem 8.4 i wprowadź tę wartość w polu "Linia bazowa V (mV)" w skrzynce elektrod pomiarowych w graficznym interfejsie użytkownika Wanda.
6. Po lewej stronie graficznego interfejsu użytkownika upewnij się, że wszystkie parametry eksperymentalne są poprawnie zarejestrowane/wprowadzone. Ustaw "Medium" na "Mózg", "Numer transportu" na średnią wartość obliczoną dla mikroelektrody jonoforetycznej w kroku 7.4, a "Temperatura" na temperaturę kąpieli zawierającej plaster.
   UWAGA: V musi być zarejestrowane dla każdego zestawu pomiarów. Linia bazowa V zostanie przeliczona przez Wandę na podstawowy parametr C (mM) (tj. stężenie TMA w tkance mózgowej).
7. Rozpocznij nagrywanie, klikając "Pobierz" i pozwól mu na pełne nagranie. Poczekaj, aż sygnał TMA powróci do linii bazowej, zanim uzyskasz nowe nagranie.
8. Wykonaj dwa lub trzy kolejne nagrania przed usunięciem mikroelektrod z wybranego miejsca w mózgu. Wprowadź zmierzoną temperaturę do oprogramowania Wanda bezpośrednio przed każdym nagraniem.
9. Przesuń obie mikroelektrody po przekątnej z powrotem na powierzchnię plastra. Podnieś oba do co najmniej 50 μm powyżej plasterka. Korzystając z rejestratora wykresów, określ wszelkie zmiany między V zmierzonym teraz a jego pomiarem z kroku 8.3.
10. Wyśrodkuj końcówki ISM i mikroelektrod jonoforetycznych względem siebie w osiach x, y i z. Uzyskaj zmiany odstępów, jeśli występują, z wyświetlacza skrzynki sterowniczej mikromanipulatora.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
wzmacniacz do ISM	Dagan	Model IX2-700 Podwójny przedwzmacniacz wewnątrzkomórkowy	wzmacniacz napięcia jonowego i odniesienia z stopniami czołowymi N=0,1 (dla lufy referencyjnej) i N=0,001 (dla lufy jonowej)
Miskop ze związkami biologicznymi (z obiektywem 4x i 10x)			do rozdrabniania końcówek mikroelektrod i kontroli mikroelektrod; różni dostawcy, np. AmScope
rurki ze szkła kapilarnego borokrzemianowego theta	Aparatura Harvarda	Warner Instruments model TG200-4; zamówienie #64-0811	dwucylindrowe rurki szklane do mikroelektrod jonoselektywnych i mikroelektrod jonoforowych; średnica zewnętrzna 2,0 mm, średnica wewnętrzna 1,4 mm, przegroda 0,2 mm, długość 10 cm
rejestrator wykresów			do ciągłego rejestrowania napięć na mikroelektrodzie jonoselektywnej podczas kalibracji w wzorcach tetrametyloamoniowych oraz podczas eksperymentu RTI; np. zarejestrowana karta dwukannelowa Kipp & Zonen typu BD112, dostępna w wersji odnowionej
Oprogramowanie komercyjne	W ramach projektu MathWorks	MATLAB, Przybornik do akwizycji danych	do pozyskiwania i analizy danych za pomocą programów Wanda i Walter. Pamiętaj, że dostępna jest licencja akademicka.
okulary ochronne	rybak
Mikroskop złożony o stałym stopniu	Olympus	BX51WI	może używać innych mikroskopów złożonych ze stałymi stolikami
Kleszcze	Narzędzia naukowe	#11251-10	do kapilary szklanej z odpryskiem; Dumond #5, najlepiej używany i nie jest już potrzebny do precyzyjnej pracy
jednostka jonoforetyczna	Dagan	ION-100 oraz PS-100	ION-100 to jednokanałowe urządzenie do jonoforezy o napięciu +/- 130 V; PS-100 to zewnętrzny zasilacz; alternatywy: np. Axoprobe-1A wyprodukowany przez Axon Instruments (obecnie Molecular Devices), wycofany z produkcji, sprawdź dostępność odnowionych jednostek (eBay i inne strony)
Uchwyt na mikroelektrody	Wskaźnik WPI	M3301EH	do przechowywania jonoselektywnego prefabrykatu mikroeletrodu do silanizacji i wypełnienia końcówki jonoselektywnej beczki ciekłym wymieniaczem jonowym; WPI sprzedaje dwie wersje tego uchwytu, bezbarwną M3301EH i czarną M3301EH. Z naszego doświadczenia wynika, że przezroczysty M3301EH wydaje się być mocniejszy niż M3301EH.
mikromanipulator	Narishige powiedział:	MM-3	do pozycjonowania prefabrykatu mikroelektrod jonoselektywnych podczas silanizacji i napełniania końcówki jonoselektywnej beczki ciekłym wymieniaczem jonowym; może być zastąpiony dowolnym mikromanipulatorem trójosiowym w dobrym stanie technicznym
Obiektyw 5x na sucho	Olympus	MPlan N
Obiektyw: 10x zanurzenie w wodzie	Olympus	UMPlan FL N	Obiektyw 10x to zanurzenie w wodzie, apertura numeryczna 0,3, odległość robocza 3,3 mm
Platforma i stolik translacyjny X-Y dla mikroskopu stałostolikowego	EXFO (Międzynarodowa Wystawa Ekscytacji	Gibraltar Burleigh	platforma mieści komorę kroczącą, mikromanipulatory i akcesoria, stolik translacyjny XY porusza mikroskopem bez uszczerbku dla stabilności zapisu
Mikromanipulator robotyczny z precyzyjnym pozycjonowaniem X,Y,Z	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał MP-285	Potrzebne są dwa mirkomanipulatory do oddzielnego przechowywania mikroelektrody jonoselektywnej i mikroelektrody jonoforetycznej. Możliwe jest również przyklejanie mikropipet w układzie rozstawionym (patrz tekst).
Kondycjoner sygnału z filtrem dolnoprzepustowym	Instrumenty firmy Axon	CyberAmp 320 lub 380	nie jest już dostępny u producenta, ale może być dostępny w serwisie E-Bay; alternatywy: np. filtr/wzmacniacz FLA-01 firmy Cygnus Technology. Jest to instrument jednokanałowy z minimalnym odcięciem przy 10 Hz przy użyciu wielobiegunowego filtra Bessela, ale firma może być skłonna do zmodyfikowania go w celu uzyskania niższej częstotliwości odcięcia (2 Hz), jeśli zajdzie taka potrzeba.
srebrny drut	Systemy A-M	Numer katalogowy #7830	średnica 0,015", goły (bez powłoki)
komora na plastry	Aparatura Harvarda	Warner Model RC-27L	To jest komora zanurzeniowa na plasterki; nie używaj komory na plasterki interfejsu
mikroskop stereoskopowy			do silanizacji i napełniania końcówki jonoselektywnej beczki ciekłym wymieniaczem jonowym; montowany poziomo; różni dostawcy
chlorek tetrametyloamonu (TMA)	Sigma-Aldrich	T-3411	Roztwór 5 M; UWAGA: toksyczność ostra (pokarmowa, skórna, inhalacyjna), rakotwórcza, stwarzająca zagrożenie dla środowiska wodnego, pełny opis znajduje się w informacjach dotyczących bezpieczeństwa Sigma-Aldrich