Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

Podsumowanie

W pierwszej kolejności neurony są charakteryzowane elektrofizjologicznie. Następnie z rejestrowanego neuronu aspiruje się cytoplazmę i poddaje ją analizie RT-PCR w celu wykrycia ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neuroprzekaźników, kanałów jonowych oraz receptorów.

Streszczenie

W ośrodkowym układzie nerwowym ssaków różne typy neuronów o zróżnicowanej charakterystyce molekularnej i funkcjonalnej są ze sobą wymieszane, co utrudnia ich separację, a także sprawia, że nie są one łatwo identyfikowalne na podstawie morfologii. W związku z tym analiza ekspresji genów w konkretnym typie neuronów jest często trudna. W niniejszym materiale dokumentujemy procedurę łączącą techniki rejestracji patch-clamp w konfiguracji whole-cell z jednokomórkową odczynną polimerazową reakcją łańcuchową z odwrotną transkrypcją (scRT-PCR) w celu profilowania ekspresji mRNA w różnych typach neuronów w istocie czarnej. W pierwszej kolejności wykorzystuje się techniki elektrofizjologiczne do rejestracji właściwości neurofizjologicznych i funkcjonalnych poszczególnych neuronów. Następnie aspiruje się cytoplazm pojedynczych, scharakteryzowanych elektrofizjologicznie neuronów istoty czarnej i poddaje analizie scRT-PCR, aby uzyskać profile ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neurotransmiterów, receptorów i kanałów jonowych. Wysoka selektywność i czułość sprawiają, że metoda ta jest szczególnie użyteczna, gdy immunohistochemia nie może zostać zastosowana z powodu braku odpowiedniego przeciwciała lub niskiego poziomu ekspresji białka. Metoda ta ma zastosowanie również do neuronów w innych obszarach mózgu.

Protokół

1. Przygotowanie skrawków mózgu

1. Wykorzystuje się młode (w wieku 15–40 dni) samce i samice szczurów Sprague-Dawley. (Ten sam protokół stosujemy również u myszy). Po wprowadzeniu w głęboką narkozę uretanową zwierzęta poddaje się dekapitacji i szybko wycina mózg. Następnie za pomocą wibrotomu Leica (VT-1200S) wykonuje się koronalne skrawki mózgu o grubości 300 μm, zawierające środkową część rostralną istoty czarnej. Procedurę cięcia przeprowadza się w lodowatym, natlenionym roztworze do cięcia o wysokim stężeniu sacharozy, zawierającym (w mM): 220 sacharozy, 2.5 KCl, 1.25 NaH₂PO₄, 25 NaHCO₃, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl₂, 10 D-glukozy. Roztwór jest napowietrzany mieszaniną 95% O₂/5% CO₂ w celu zapewnienia natlenienia i utrzymania pH na poziomie 7.4. Przez całą procedurę należy utrzymywać roztwór do cięcia w temperaturze lodowej.
2. Skrawki mózgu inkubuje się w komorze inkubacyjnej wypełnionej natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) zawierającym (w mM): 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH₂PO₄, 25 NaHCO₃, 2.5 CaCl₂, 1.3 MgCl₂, 10 D-glukozy. Jest on napowietrzany mieszaniną 95% O₂/5% CO₂ w celu zapewnienia natlenienia i utrzymania pH na poziomie 7.4. Inkubację prowadzi się w temperaturze 34 °C przez 45 min, a następnie w temperaturze pokojowej aż do momentu przeniesienia skrawka mózgu do komory rejestracyjnej.

2. Elektrofizjologiczna charakterystyka neuronów istoty czarnej

1. Jeden skrawek mózgu przenosi się do komory rejestracyjnej patch-clamp, stale perfundowanej natlenionym aCSF w temperaturze 32 °C.
2. Pipety do patch-clamp wyciąga się z autoklawowanych szklanych kapilar borokrzemianowych (KG-33) (wewn. 1.10 mm, zewn. 1.65 mm, King Precision Glass, Claremont, CA) przy użyciu wyciągarki PC-10 (Narishige, Tokio, Japonia) i napełnia roztworem wewnątrzkomórkowym przygotowanym z wody wolnej od DNaz i RNaz (Fisher Scientific) (zawierającym 135 mM KCl, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl₂, z pH dostosowanym do 7.3). Pipety do patch-clamp mają oporność 2-3 MΩ w kąpieli.
3. Istotę czarną identyfikuje się na podstawie jej charakterystycznego położenia anatomicznego (Rys. 1A1-2). Pod kontrolą wizualną mikroskopu wideo (Olympus BX51W1) wyposażonego w optykę Nomarskiego i obiektyw imersyjny 60X, do rejestracji wybiera się duże komórki w części zwartej istoty czarnej (SNc) oraz części siateczkowatej istoty czarnej (SNr) (prawdopodobne neurony DA i neurony GABA). Uzyskuje się konwencjonalną konfigurację whole-cell z gigaomowym uszczelnieniem (Rys. 1B1). Można przeprowadzić analizy w trybie current clamp oraz voltage clamp. Aby zminimalizować degradację mRNA, rejestracja elektrofizjologiczna powinna być krótka (≤5 min). Jedną z opcji jest rejestracja wyłącznie właściwości błonowych i impulsowania, aby uzyskać elektrofizjologiczne sygnatury interesujących neuronów (Rys. B2-3). Taka krótka rejestracja trwa jedynie około 1 min.

3. Aspiracja cytoplazmy

1. Po elektrofizjologicznym profilowaniu i charakterystyce neuronów GABA i DA w SNr, stosuje się delikatne ssanie ustami w celu aspiracji cytoplazmy. Może dojść również do aspiracji jądra komórkowego, co skutkuje zanieczyszczeniem genomowym DNA. Szczelne połączenie (seal) nie powinno zostać przerwane; w przeciwnym razie do pipety patch mogą zostać zassane zanieczyszczenia z przestrzeni pozakomórkowej, w tym mRNA, co zanieczyści zawartość komórki. Szczelność połączenia uznaje się za dobrą, dopóki wzrost prądu podtrzymującego przy -70 mV nie przekracza 100 pA.
2. Następnie zasysaną zawartość komórki wypycha się do probówki PCR o pojemności 0.2 mL poprzez odłamanie końcówki pipety i przyłożenie niewielkiego dodatniego ciśnienia. Zawartość jednej komórki zbiera się do jednej probówki PCR. Po pobraniu zawartości komórki, probówkę PCR, uprzednio schłodzoną na lodzie, natychmiast umieszcza się w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
3. Aby wykluczyć zanieczyszczenie szczątkami pozakomórkowymi, które mogą zawierać mRNA, pipetę patch opuszcza się do tkanki bez faktycznej aspiracji cytoplazmy, a następnie zawartość pipety poddaje się analizie RT-PCR.

4. Odpisanie zwrotne (RT)

1. Po pobraniu zawartości komórkowej z odpowiedniej liczby neuronów, zazwyczaj 10-20, należy niezwłocznie rozpocząć reakcję RT, aby zminimalizować degradację mRNA.
2. Ze względu na zbyt małą ilość zawartości komórkowej z pojedynczego neuronu, nie przeprowadza się procedury izolacji RNA. Aby usunąć potencjalnie zanieczyszczające DNA genomowe, aspirowaną zawartość komórkową najpierw trawi się za pomocą DNazy I (5 μL DNazy I oraz 1,6 μL buforu do DNazy I, 5 min w 25 °C). Następnie DNazę I inaktywuje się poprzez dodanie 1,2 μL 25 mM EDTA i inkubację w 75 °C przez 5 min.
3. cDNA syntetyzuje się przy użyciu zestawu do syntezy cDNA Cells-Direct opartego na odwrotnej transkryptazie SuperScript III (Invitrogen, Tabela 1). Pierwszą nić cDNA syntetyzuje się w 50 °C przez 50 min, następnie reakcję inaktywuje się poprzez inkubację w 85 °C przez 5 min i dodaje 1 μL RNazy H w celu strawienia mRNA (37 °C przez 20 min). Jednoniciowe cDNA przechowuje się w -20 °C do późniejszej amplifikacji PCR.
4. Całkowite usunięcie DNA genomowego weryfikuje się za pomocą kontroli RT-minus, w której pomija się dodanie odwrotnej transkryptazy, podczas gdy wszystkie pozostałe składniki reakcji pozostają dokładnie takie same.

5. Dwuetapowa amplifikacja PCR

1. Startery zaprojektowano zgodnie z sekwencjami w GenBank. W miarę możliwości stosowano pary starterów obejmujące introny, co pomaga w wykrywaniu kontaminacji DNA genomowym. Sekwencje par starterów wymieniono w Tabeli 2. Skuteczność par starterów należy najpierw zweryfikować przy użyciu mRNA z całego mózgu, które dają produkty pozytywne. Wszystkie startery zostały zsyntetyzowane przez Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, USA).
2. W pierwszym etapie 5 μL z 30 μL cDNA poddaje się amplifikacji przez 35 cykli w obecności pary starterów (Tabela 2). Protokół termocyklingu w termocyklerze (MasterCycler, Eppendorf, Tabela 1) obejmuje 2 min w 94 °C dla denaturacji wstępnej, następnie 35 cykli: 15 s w 94 °C dla denaturacji, 30 s w 55°C dla przyłączania i 45 s w 72°C dla elongacji, a następnie 7 min dla elongacji końcowej. Polimeraza DNA Taq, odwrotne nukleotydy trifosforanowe (dNTPs) oraz wszystkie pozostałe składniki niezbędne do amplifikacji PCR są dostarczane w formie supermixu do PCR (Invitrogen, Tabela 1)
3. W drugim etapie PCR jako matrycy używa się 1 μL produktu z amplifikacji PCR z 1^st etapu oraz tej samej pary starterów, która była stosowana w pierwszym etapie (Tabela 2). Przeprowadza się 40 cykli z czasem elongacji skróconym do 30 s. Stosuje się ten sam supermix do PCR.
4. Produkty PCR z amplifikacji z 2^nd etapu rozdziela się za pomocą elektroforezy w 2,5% żelu agarozowym, wizualizuje za pomocą bromku etydyny (0,05 mg/100 mL żelu) lub GelGreen w świetle UV, a następnie fotografuje (Rys. B4). Pozytywne prążki są następnie wycinane, ekstrahowane za pomocą zestawu do ekstrakcji Qiagen (Tabela 1), a następnie sekwencjonowane i porównywane z opublikowanymi sekwencjami genów docelowych.

6. Reprezentatywne wyniki:

Neurony dopaminergiczne (DA) w istocie czarnej części zwartej i części siateczkowatej oraz sąsiednie neurony projekcyjne GABA w istocie czarnej części siateczkowatej posiadają odmienne charakterystyki elektrofizjologiczne (Zhou et al. 2006; Ding et al. 2011). Jak pokazano na Ryc. 1B2, neurony GABA w SNr wykazują wysoką częstotliwość spontanicznych potencjałów czynnościowych wynoszącą około 10 Hz. Spiki te mają czas trwania bazy około 1 ms. Po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego, neurony GABA w SNr wykazują słaby ugięcie (sag) depolaryzacyjne w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego, co wskazuje na słabą ekspresję prądu I_h w tych neuronach (Ryc. 1B2). W przeciwieństwie do nich, neurony DA istoty czarnej wykazują niską częstotliwość (około 2 Hz) spontanicznych spików, których czas trwania bazy wynosi około 3 ms. Neurony DA wykazują również wyraźne ugięcie w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego, co świadczy o silnej ekspresji prądu I_h (Ryc. 1B3) (Zhou et al. 2006; Ding et al. 2011).

Metodą scRT-PCR wykryto mRNA dladekarboksylazy kwasu glutaminowego 1 (GAD1, kluczowy enzym syntezy GABA i marker neuronów GABAergicznych) w neuronach GABAergicznych SNr zidentyfikowanych elektrofizjologicznie, ale nie w neuronach DA (Rys. 1B4,5). Z kolei scRT-PCR wykazała obecność mRNA dla hydroksylazy tyrozynowej (TH, kluczowy enzym syntezy dopaminy i marker neuronów DA) w neuronach DA w SNc i SNr zidentyfikowanych elektrofizjologicznie, ale nie w neuronach GABAergicznych (Rys. 1B4,5). Wyniki scRT-PCR potwierdzają zatem elektrofizjologiczną identyfikację neuronów. Następnie scRT-PCR wykorzystano do profilowania ekspresji podjednostek kanałów Kv3 aktywowanych napięciem: Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 oraz Kv3.4. Podjednostki te współtworzą napięciowo zależne kanały K⁺ o zróżnicowanych właściwościach, zależnie od składu podjednostek (Ding et al. 2011). W przykładzie neuronu GABAergicznego SNr przedstawionym na Rys. 1B4 wykryto mRNA dla Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. W przykładzie neuronu DA w SNr przedstawionym na Rys. 1B5 wykryto jedynie Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. W naszych zbiorczych danych Kv3.1 wykryto częściej w neuronach GABAergicznych SNr niż w nigralnych neuronach DA, co wskazuje na wyższy poziom ekspresji Kv3.1 w szybko wyładowujących się neuronach GABAergicznych SNr (Ding et al. 2011).

Rycina 1. Elektrofizjologiczna identyfikacja neuronów GABA w SNr i neuronów DA w istocie czarnej. A: obszary istoty czarnej można zidentyfikować na podstawie ich charakterystycznego położenia anatomicznego. A1 przedstawia lokalizację SNc i SNr w koronalnym przekroju barwionym metodą Nissla, wykonanym przy użyciu obiektywu 1X. Obszar zaznaczony ramką został uchwycony obiektywem 10X i wyświetlony w środku, zgodnie ze wskazaniem strzałki. Wyraźnie widoczne są bogata w komórki SNc oraz uboga w komórki SNr. A2 przedstawia lokalizację SNc i SNr w żywym, niebarwionym przekroju koronalnym, wykonanym przy użyciu obiektywu 4X. Bogata w komórki SNc i uboga w komórki SNr są również wyraźnie możliwe do zidentyfikowania. VTA, pole brzuszne nakrywy. B1 przedstawia neuron GABA w SNr poddany rejestracji metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell. B2 pokazuje typowe właściwości elektrofizjologiczne neuronów GABA w SNr w trybie rejestracji current clamp. Neurony te generują spontaniczne potencjały czynnościowe o wysokiej częstotliwości i krótkim czasie trwania oraz wykazują słabą odpowiedź typu sag zależną od prądu I_h po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego. B3 przedstawia typowe właściwości elektrofizjologiczne neuronów DA w istocie czarnej w trybie rejestracji current clamp. Generują one spontaniczne potencjały czynnościowe o niskiej częstotliwości i długim czasie trwania oraz wykazują wyraźną odpowiedź typu sag (grot strzałki) zależną od prądu I_h po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego. W ten sposób neurony GABA w SNr oraz neurony dopaminergiczne w istocie czarnej zostają jasno zidentyfikowane elektrofizjologicznie. B4 przedstawia obraz żelu produktów scRT-PCR z elektrofizjologicznie zidentyfikowanego neuronu GABA w SNr. Wykryto mRNA dla dehydrogenazy glutaminianowej 1 (GAD1), ale nie wykryto mRNA dla hydroksylazy tyrozynowej (TH). W tym neuronie GABA w SNr wykryto mRNA dla Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. B5 pokazuje detekcję scRT-PCR mRNA neuronalnych kanałów Kv3 w neuronie DA w SNr. W elektrofizjologicznie zidentyfikowanym neuronie DA w SNr wykryto mRNA dla TH, ale nie dla GAD1. W tym neuronie DA w SNr wykryto mRNA dla Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. B6 przedstawia zagregowane dane.

7. Potencjalne wyniki fałszywie ujemne i fałszywie dodatnie

W oparciu o nasze doświadczenie, kilka czynników może prowadzić do fałszywie ujemnych wyników scRT-PCR. Czynniki te obejmują niepowodzenie w odessaniu wystarczającej ilości cytoplazmy z powodu zapchania końcówki pipety patch, zanieczyszczenie RNazami oraz nieefektywne primery PCR. Zapchanie końcówki pipety patch jest zazwyczaj widoczne na monitorze wideo i objawia się zwiększonym oporem dostępu. Zanieczyszczenia RNazami można uniknąć poprzez dokładną dezaktywację i noszenie rękawiczek. Skuteczność primerów PCR należy przetestować, wykorzystując całkowite RNA z wycinka tkanki mózgowej (Zhou et al. 2008; Ding et al. 2011).

Ponieważ zawsze stosujemy DNazę do wstępnego traktowania próbek przed RT, nie odnotowaliśmy wyników fałszywie dodatnich. Teoretycznie, bez trawienia DNazą, może dojść do kontaminacji DNA genomowym i w konsekwencji do fałszywie dodatniego wykrycia w przypadku, gdy gen nie posiada intronów lub gdy para starterów nie obejmuje regionu intronowego.

Dyskusja

Połączenie rejestracji metodą patch clamp w skrawkach mózgu z techniką scRT-PCR, którą tutaj zaprezentowaliśmy, stanowi doskonałą metodę badania profili ekspresji mRNA kanałów jonowych, receptorów oraz kluczowych enzymów syntezy neurotransmiterów w indywidualnie scharakteryzowanych neuronach. Jest to szczególnie użyteczne w sytuacjach, gdy białko nie może zostać wykryte i zlokalizowane za pomocą innych metod, takich jak immunohistochemia, ze względu na niski poziom ekspresji i/lub brak odpowiedniego przeciwciała (Surmeie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela 1. Kluczowe odczynniki i sprzęt
Tabela 2. Pary starterów dla mRNA kanałów Kv3 neuronów szczura, hydroksylazy tyrozynowej (TH) orazdekarboksylazy kwasu glutaminowego 1 (GAD1) do scRT-PCR