Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

Podsumowanie

W pierwszej kolejności neurony są charakteryzowane elektrofizjologicznie. Następnie z rejestrowanego neuronu aspiruje się cytoplazmę i poddaje ją analizie RT-PCR w celu wykrycia ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neuroprzekaźników, kanałów jonowych oraz receptorów.

Streszczenie

W ośrodkowym układzie nerwowym ssaków różne typy neuronów o zróżnicowanej charakterystyce molekularnej i funkcjonalnej są ze sobą wymieszane, co utrudnia ich separację, a także sprawia, że nie są one łatwo identyfikowalne na podstawie morfologii. W związku z tym analiza ekspresji genów w konkretnym typie neuronów jest często trudna. W niniejszym materiale dokumentujemy procedurę łączącą techniki rejestracji patch-clamp w konfiguracji whole-cell z jednokomórkową odczynną polimerazową reakcją łańcuchową z odwrotną transkrypcją (scRT-PCR) w celu profilowania ekspresji mRNA w różnych typach neuronów w istocie czarnej. W pierwszej kolejności wykorzystuje się techniki elektrofizjologiczne do rejestracji właściwości neurofizjologicznych i funkcjonalnych poszczególnych neuronów. Następnie aspiruje się cytoplazm pojedynczych, scharakteryzowanych elektrofizjologicznie neuronów istoty czarnej i poddaje analizie scRT-PCR, aby uzyskać profile ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neurotransmiterów, receptorów i kanałów jonowych. Wysoka selektywność i czułość sprawiają, że metoda ta jest szczególnie użyteczna, gdy immunohistochemia nie może zostać zastosowana z powodu braku odpowiedniego przeciwciała lub niskiego poziomu ekspresji białka. Metoda ta ma zastosowanie również do neuronów w innych obszarach mózgu.

Protokół

1. Przygotowanie skrawków mózgu

1. Stosuje się młode (w wieku 15-40 dni) samce i samice szczurów Sprague-Dawley. (Ten sam protokół stosujemy również u myszy). Po wprowadzeniu w głęboką narkozę uretanową zwierzęta zostają poddane dekapitacji, a mózg jest szybko wycinany. Następnie na wibratomie Leica (VT-1200S) wykonuje się koronalne skrawki mózgu o grubości 300 μm zawierające środkową część rostralną istoty czarnej. Procedura cięcia skrawków odbywa się w lodowatym, napowietrzonym roztworze do cięcia o wysokim stężeniu sacharozy zawierającym (w mM): 220 sacharozy, 2.5 KCl, 1.25 NaH₂PO₄, 25 NaHCO₃, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl₂, 10 D-glukozy. Roztwór jest napowietrzany mieszaniną 95% O₂/5% CO₂ w celu utrzymania natlenienia oraz pH na poziomie 7.4. Przez całą procedurę należy utrzymywać roztwór do cięcia w temperaturze lodowej.
2. Skrawki mózgu inkubuje się w komorze inkubacyjnej wypełnionej napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) zawierającym (w mM): 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH₂PO₄, 25 NaHCO₃, 2.5 CaCl₂, 1.3 MgCl₂, 10 D-glukozy. Płyn jest napowietrzany mieszaniną 95% O₂/5% CO₂ w celu utrzymania natlenienia oraz pH na poziomie 7.4. Temperatura inkubacji wynosi 34 °C przez 45 min, a następnie temperatura pokojowa aż do momentu przeniesienia skrawka mózgu do komory rejestracyjnej.

2. Elektrofizjologiczna charakterystyka neuronów istoty czarnej

1. Przekrój mózgu przenosi się do komory do rejestracji patch-clamp, w której stale perfundowany jest natleniony aCSF w temperaturze 32 °C.
2. Pipety do patch-clampu są wyciągane z autoklawowanych szklanych kapilar borokrzemianowych (KG-33) (1.10 mm i.d., 1.65 mm o.d., King Precision Glass, Claremont, CA) przy użyciu wyciągarki PC-10 (Narishige, Tokyo, Japan) i napełniane roztworem wewnątrzkomórkowym przygotowanym w wodzie wolnej od DNazy i RNazy (Fisher Scientific) (zawierającym 135 mM KCl, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl₂, pH dostrojone do 7.3). Pipety do patch-clampu mają oporność 2-3 MΩ w kąpieli.
3. Istotę czarną identyfikuje się na podstawie jej charakterystycznej lokalizacji anatomicznej (Rys. 1A1-2). Pod kontrolą wizualną mikroskopu wideo (Olympus BX51W1) wyposażonego w optykę Nomarskiego i obiektyw imersyjny 60X, do rejestracji wybiera się duże komórki w części zwartej istoty czarnej (SNc) oraz części siateczkowatej istoty czarnej (SNr) (prawdopodobne neurony DA i neurony GABA). Uzyskuje się konwencjonalną konfigurację whole-cell z gigaomowym uszczelnieniem (Rys. 1B1). Można przeprowadzić analizy w trybie current clamp oraz voltage clamp. Aby zminimalizować degradację mRNA, rejestracja elektrofizjologiczna powinna być krótka (≤5 min). Jedną z opcji jest rejestracja wyłącznie właściwości błonowych i impulsowania, aby uzyskać elektrofizjologiczne sygnatury interesujących neuronów (Rys. B2-3). Taka krótka rejestracja trwa tylko około 1 min.

3. Aspiracja cytoplazmy

1. Po elektrofizjologicznym profilowaniu i charakterystyce neuronów GABA-ergicznych i dopaminergicznych (DA) w obrębie SNr, delikatnie zasysa się cytoplazmę. Może dojść również do zasysania jądra komórkowego, co prowadzi do kontaminacji genomowym DNA. Należy unikać przerwania szczelnego uszczelnienia (tight seal); w przeciwnym razie do pipety patchowej mogą zostać zassane zanieczyszczenia z przestrzeni pozakomórkowej, w tym mRNA, co zanieczyści zawartość komórki. Szczelność uszczelnienia uznaje się za dobrą, jeśli wzrost prądu podtrzymującego przy -70 mV nie przekracza 100 pA.
2. Następnie zassana zawartość komórki jest wydmuchiwana do probówki PCR o pojemności 0,2 mL poprzez odłamanie końcówki pipety i zastosowanie niewielkiego nadciśnienia. Zawartość jednej komórki jest zbierana do jednej probówki PCR. Po pobraniu zawartości komórki, probówkę PCR, uprzednio schłodzoną w lodzie, natychmiast umieszcza się w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
3. Aby wykluczyć kontaminację zanieczyszczeniami pozakomórkowymi, które mogą zawierać mRNA, pipetę patchową opuszcza się do tkanki bez faktycznego zasysania cytoplazmy, a następnie zawartość pipety poddaje się analizie RT-PCR.

4. Odpis odwrotny (RT)

1. Po zebraniu zawartości komórkowej z odpowiedniej liczby neuronów, zazwyczaj 10-20, należy niezwłocznie rozpocząć reakcję RT, aby zminimalizować degradację mRNA.
2. Ze względu na to, że ilość zawartości komórkowej z pojedynczego neuronu jest zbyt mała, nie przeprowadza się procedury izolacji RNA. Aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia w postaci DNA genomowego, aspirowaną zawartość komórkową najpierw trawiono DNazą I (5 μL DNase I i 1,6 μL DNase I Buffer, 5 min w 25 °C). Następnie DNazę I inaktywowano poprzez dodanie 1,2 μL 25 mM EDTA i inkubację w 75 °C przez 5 min.
3. cDNA syntetyzowano przy użyciu zestawu Cells-Direct cDNA Synthesis opartego na odwrotnej transkryptazie SuperScript III (Invitrogen, Tabela 1). Pierwsza nić cDNA była syntetyzowana w 50 °C przez 50 min, następnie reakcję inaktywowano poprzez inkubację w 85 °C przez 5 min i dodano 1 μL RNazy H w celu trawienia mRNA (37 °C przez 20 min). Jednoniciowe cDNA przechowywano w -20 °C do późniejszej amplifikacji PCR.
4. Całkowite usunięcie DNA genomowego weryfikowano za pomocą kontroli RT-minus, w której pominięto odwrotną transkryptazę, podczas gdy wszystkie pozostałe składniki reakcji były identyczne.

5. Dwuetapowa amplifikacja PCR

1. Startery zaprojektowano na podstawie sekwencji w bazie GenBank. W miarę możliwości stosowano pary starterów obejmujące introny, co ułatwia wykrycie kontaminacji DNA genomicznym. Sekwencje par starterów wymieniono w Tabela 2Skuteczność par starterów należy najpierw zweryfikować za pomocą mRNA z całego mózgu, które dają pozytywne produkty. Wszystkie startery zostały zsyntetyzowane przez Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, USA).
2. W pierwszym etapie, 5 μL z 30 μL cDNA poddawane jest amplifikacji przez 35 cykli w obecności pary starterów (Tabela 2). Protokół cykli termicznych termocyklera (MasterCycler, Eppendorf, Tabela 1) wynosi 2 min w temperaturze 94 °C do początkowej denaturacji, następnie 35 cykli po 15 s w temperaturze 94 °C w celu denaturacji, 30 s w temperaturze 55°C do przyłączania (annealingu), oraz 45 s w temperaturze 72°C do przedłużenia, a następnie przez 7 min w celu końcowej elongacji. Taq polimeraza DNA, trifosforany deoksynukleotydów (dNTPs) oraz wszystkie pozostałe komponenty niezbędne do amplifikacji PCR są dostarczane w formie gotowej mieszaniny PCR (super mix) (Invitrogen, Tabela 1)
3. W drugim etapie PCR produkt z 1 μL z 1^{Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.} produkt amplifikacji PCR z pierwszego etapu służy jako matryca i stosuje się tę samą parę starterów, która była użyta w pierwszym etapie (Tabela 2). Przeprowadza się 40 cykli, skracając czas elongacji do 30 s. Stosuje się ten sam supermix do PCR.
4. produkty PCR z 2^nd produkty amplifikacji rozdziela się za pomocą elektroforezy w 2,5% żelu agarozowym, wizualizuje przy użyciu bromku etydyny (0,05 mg/100 ml żelu) lub GelGreen w świetle UV, a następnie fotografuje (Ryc. B4). Następnie wycina się pasma dodatnie i poddaje je ekstrakcji przy użyciu zestawu ekstrakcyjnego Qiagen (Tabela 1) i poddano sekwencjonowaniu, a następnie porównano z opublikowanymi sekwencjami genów docelowych.

6. Reprezentatywne wyniki:

Neurony dopaminergiczne (DA) w istocie czarnej części zwartej (substantia nigra pars compacta) i części siateczkowatej (pars reticulata) oraz sąsiadujące neurony projekcyjne GABA-ergiczne w istocie czarnej części siateczkowatej wykazują odmienne charakterystyki elektrofizjologiczne (Zhou et al. 2006; Ding et al. 2011). Jak pokazano na Rys. 1B2, neurony GABA w SNr wykazują spontaniczną aktywność impulsową o wysokiej częstotliwości, wynoszącej około 10 Hz. Impulsy te mają czas trwania bazy około 1 ms. Po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego, neurony GABA w SNr wykazują słaby ugięcie (sag) depolaryzacyjne w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego, co wskazuje na słabą ekspresję prądu I_h w tych neuronach (Rys. 1B2). W przeciwieństwie do nich, neurony DA istoty czarnej wykazują spontaniczne impulsy o niskiej częstotliwości (około 2 Hz), których czas trwania bazy wynosi około 3 ms. Neurony DA wykazują również wyraźne ugięcie (sag) w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego, co świadczy o silnej ekspresji prądu I_h (Rys. 1B3) (Zhou et al. 2006; Ding et al. 2011).

Metodą scRT-PCR wykryto mRNA dladekarboksylazy kwasu glutaminowego 1 (GAD1, kluczowy enzym syntezy GABA i marker neuronów GABAergicznych) w elektrofizycznie zidentyfikowanych neuronach GABAergicznych SNr, ale nie w neuronach DA (Ryc. 1B4,5). Z kolei scRT-PCR wykazała obecność mRNA dla hydroksylazy tyrozynowej (TH, kluczowy enzym syntezy dopaminy i marker neuronów DA) w elektrofizycznie zidentyfikowanych neuronach DA w SNc i SNr, ale nie w neuronach GABAergicznych (Ryc. 1B4,5). Wyniki scRT-PCR potwierdzają zatem elektrofizyczną identyfikację neuronów. Następnie scRT-PCR wykorzystano do profilowania ekspresji podjednostek bramkowanych napięciowo kanałów Kv3: Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 oraz Kv3.4. Podjednostki te współtworzą napięciowo zależne kanały K⁺ o zróżnicowanych właściwościach, zależnych od składu podjednostek (Ding et al. 2011). W przykładzie neuronu GABAergicznego SNr przedstawionym na Ryc. 1B4 wykryto mRNA dla Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. W przykładzie neuronu DA w SNr przedstawionym na Ryc. 1B5 wykryto jedynie Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. W naszych zbiorczych danych Kv3.1 wykryto częściej w neuronach GABAergicznych SNr niż w nigralnych neuronach DA, co wskazuje na wyższy poziom ekspresji Kv3.1 w szybko wyładowujących neuronach GABAergicznych SNr (Ding et al. 2011).

Rysunek 1. Elektrofizjologiczna identyfikacja neuronów GABA w SNr i neuronów DA w istocie czarnej. A: obszary istoty czarnej można zidentyfikować na podstawie ich wyraźnej lokalizacji anatomicznej. A1 przedstawia lokalizację SNc i SNr w koronalnym przekroju barwionym metodą Nissla, wykonanym przy użyciu obiektywu 1X. Obszar w ramce został uchwycony obiektywem 10X i wyświetlony w środku, zgodnie ze wskazaniem strzałki. Wyraźnie widoczne są bogata w komórki SNc oraz uboga w komórki SNr. A2 przedstawia lokalizację SNc i SNr w żywym, niebarwionym przekroju koronalnym, wykonanym przy użyciu obiektywu 4X. Bogata w komórki SNc i uboga w komórki SNr są również wyraźnie identyfikowalne. VTA, pole brzuszne nakrywki. B1 przedstawia neuron GABA w SNr poddany rejestracji patch-clamp w trybie whole-cell. B2 przedstawia typowe właściwości elektrofizjologiczne neuronów GABA w SNr w trybie rejestracji current-clamp. Neurony te generują spontaniczne, wysokoczęstotliwościowe potencjały czynnościowe o krótkim czasie trwania i wykazują słabą odpowiedź typu sag zależną od prądu I_h po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego. B3 przedstawia typowe właściwości elektrofizjologiczne neuronów DA w istocie czarnej w trybie rejestracji current-clamp. Generują one spontaniczne, niskoczęstotliwościowe potencjały czynnościowe o długim czasie trwania i wykazują wyraźną odpowiedź typu sag (grot strzałki) zależną od prądu I_h po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego. W ten sposób neurony GABA w SNr i neurony dopaminergiczne w istocie czarnej są jednoznacznie identyfikowane elektrofizjologicznie. B4 przedstawia obraz żelu z produktami scRT-PCR z elektrofizjologicznie zidentyfikowanego neuronu GABA w SNr. Wykryto mRNA dla dehydrogenazy glutaminianowej 1 (GAD1), ale nie wykryto mRNA dla hydroksylazy tyrozynowej (TH). W tym neuronie GABA w SNr wykryto mRNA dla Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. B5 przedstawia detekcję scRT-PCR mRNA neuronalnych kanałów Kv3 w neuronie DA w SNr. W elektrofizjologicznie zidentyfikowanym neuronie DA w SNr wykryto mRNA dla TH, ale nie dla GAD1. W tym neuronie DA w SNr wykryto mRNA dla Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. B6 przedstawia dane zbiorcze.

7. Potencjalne wyniki fałszywie ujemne i fałszywie dodatnie

W oparciu o nasze doświadczenie, kilka czynników może prowadzić do fałszywie ujemnych wyników scRT-PCR. Czynniki te obejmują niepowodzenie w odessaniu wystarczającej ilości cytoplazmy z powodu zapchania końcówki pipety patch, kontaminację RNazą oraz niską wydajność starterów PCR. Zapchanie końcówki pipety patch jest zazwyczaj widoczne na monitorze wideo i objawia się zwiększonym oporem dostępowym. Kontaminacji RNazą można zapobiec poprzez dokładną dezaktywację i noszenie rękawiczek. Skuteczność starterów PCR należy sprawdzić, wykorzystując całkowite RNA z wycinka tkanki mózgu (Zhou et al. 2008; Ding et al. 2011).

Ponieważ przed RT zawsze poddajemy nasze próbki wstępnej obróbce DNazą, nie odnotowaliśmy wyników fałszywie dodatnich. Teoretycznie, bez trawienia DNazą, może dojść do zanieczyszczenia DNA genomicznym i w konsekwencji do fałszywie dodatniego wykrycia w przypadku, gdy gen nie posiada intronów lub gdy para starterów nie obejmuje regionu intronowego.

Dyskusja

Połączenie rejestracji metodą patch clamp w skrawkach mózgu z techniką scRT-PCR, którą tutaj zaprezentowaliśmy, stanowi doskonałą metodę badania profili ekspresji mRNA kanałów jonowych, receptorów oraz kluczowych enzymów syntezy neurotransmiterów w indywidualnie scharakteryzowanych neuronach. Jest to szczególnie użyteczne w sytuacjach, gdy białko nie może zostać wykryte i zlokalizowane za pomocą innych metod, takich jak immunohistochemia, ze względu na niski poziom ekspresji i/lub brak odpowiedniego przeciwciała (Surmeie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela 1. Kluczowe odczynniki i sprzęt
Tabela 2. Pary starterów dla mRNA kanałów Kv3 neuronów szczura, hydroksylazy tyrozynowej (TH) orazdekarboksylazy kwasu glutaminowego 1 (GAD1) do scRT-PCR