Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
C57BL/6 (H-2b) samice myszy w wieku 8 tygodni zostały zakupione, a myszy C57BL/6 AQP4-/- zostały dostarczone przez A. Verkmana.
1. Immunizacja myszy peptydami AQP4
- Przygotuj kompletny zapas roboczy adiuwanta Freunda (CFA).
- Drobno zmielić wysuszony preparat Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) za pomocą moździerza i tłuczka.
- Dodać zmielony H37Ra do niekompletnego adiuwantu Freunda do końcowego stężenia 4 mg/ml. CFA może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
- Rozpuścić peptyd AQP4 liofilizowanego antygenu (Ag) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 1 mg/ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
- Przygotować zestaw 2 strzykawek typu luer-lock, połączonych kranem, zawierających emulsję CFA/peptyd.
- Podłącz szklaną strzykawkę typu luer-lock bez tłoka do 3-drożnego nylonowego kranu z 2 męskimi złączami luer-lock. Zamknąć kurek, przesuwając dźwignię w kierunku strzykawki. Ustawić otwarty koniec strzykawki do góry, pozwalając strzykawce działać jak probówka. Umieść go w stojaku na tuby, aby zwiększyć stabilność.
- Odwirować materiał roboczy CFA i roztwór Ag. Dodać objętość peptydu / CFA w stosunku 1:1 do otwartej strzykawki. Wymagane jest 200 μl CFA/Ag (4 x 50 μL) na mysz.
nuta: Zazwyczaj około 1 ml preparatu jest tracone w kurku, co zmniejsza ilość dostępną do szczepienia. Dlatego ważne jest, aby uwzględnić to w obliczeniach wymaganej całkowitej objętości.
Przykład: Do immunizacji 5 myszy: (200 μl/zwierzę x 5 zwierząt) + 1 ml dodatkowej objętości = wymagane 2 ml całkowitego CFA/Ag.
- Włożyć szklany tłok do strzykawki i trzymając go na miejscu, odwrócić strzykawkę tak, aby kran był skierowany do góry. Przełącz dźwignię kranu na nieużywane złącze żeńskie. Ostrożnie docisnąć szklany tłok w celu usunięcia nadmiaru powietrza ze strzykawki. Ciecz wypełnia drugie męskie przyłącze luer-lock kurka.
- Podłączyć drugą szklaną strzykawkę (tłok całkowicie włożony) do drugiego męskiego złącza luer-lock kurka. Powinien to być zamknięty system 2 szklanych strzykawek połączonych kranem zawierającym jak najmniej nadmiaru powietrza.
- Aby utworzyć emulsję, należy mieszać, naciskając tłoki, aby płyn przepływał naprzemiennie między 2 strzykawkami przez około 2 minuty. Schładzać strzykawki na lodzie przez około 10 minut. Powtarzać schładzanie i mieszanie, aż nastąpi wyraźna zmiana lepkości preparatu, w wyniku czego powstanie bardzo sztywna, biała emulsja. Strzykawki zawierające emulsję należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C lub przechowywać na lodzie.
- Przenieść całą emulsję do jednej szklanej strzykawki typu luer-lock, wyjąć pustą szklaną strzykawkę i zastąpić ją strzykawką typu luer-lock o pojemności 1 ml do wstrzykiwań. Napełnić nową strzykawkę emulsją, wyjąć ją z kranu i założyć igłę (25G x 5/8).
- "Przetestuj wodę" emulsję pod kątem konsystencji. Wylej kroplę emulsji do małego naczynia z wodą. Emulsja nie powinna się rozpraszać, co wskazuje, że nadaje się do wstrzykiwań.
- Jeśli emulsja dyspersjonuje się, nie jest gotowa do wstrzyknięcia; przenieść płyn z powrotem do szklanych strzykawek i kontynuować mieszanie, a następnie ponownie schłodzić, aż emulsja stanie się sztywna.
- Ponownie przetestuj emulsję, aż do uzyskania odpowiedniej konsystencji.
- Wstrzyknąć myszom AQP4-/- dawcy podskórnie (s.c.) emulsję zawierającą peptyd AQP4. Każda mysz otrzymuje 4 x 50 μL s.c. zastrzyki (łącznie 200 μL (100 μg peptydu)). 4 miejsca obejmują obie strony dolnej części brzucha, które spływają do pachwinowych węzłów chłonnych (LN) oraz obie strony ściany klatki piersiowej przyśrodkowo do każdej pachy, które spływają do pachowego LN. Transfer adopcyjny będzie wymagał 1-2 zaszczepionych myszy dawców na mysz biorcę.
2. Hodowla limfocytów T i polaryzacja prozapalnych limfocytów T
- 10-12 dni po szczepieniu zbierz LN od myszy.
- W tacce na lód przygotuj szalki Petriego o średnicy 60 mm wyposażone w sitko komórkowe (rozmiar oczek 70 μm) i zawierające schłodzone podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI) z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny-100 μg/ml streptomycyny (pen-strep) (RFPS).
- Poddaj myszy eutanazji przez narażenie na CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Zanurz myszy w 70% etanolu, a następnie przypnij każdą podkładkę do deski sekcyjnej.
- Wytnij nacięcie skóry w linii środkowej od pachwiny do szyi i w dół każdej nogi. Odciągnij skórę od otrzewnej i przypnij ją mocno do deski. Rozciąć LN pachwinowy i pachowy i umieścić na szalce Petriego zawierającej RFPS, na lodzie.
- W przypadku eksperymentów z transferem adopcyjnym należy połączyć LN ze wszystkich zwierząt w tej samej grupie immunizacji. W przypadku analiz cytometrii przepływowej użycia Vβ należy oddzielić LN od poszczególnych zwierząt.
- Umieść sitko komórkowe zawierające LN na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej RFPS. Użyj płaskiego końca sterylnego tłoka strzykawki o pojemności 5 ml, aby przecisnąć komórki LN przez sitko, przemując 20-30 ml RFPS, aby ułatwić odzyskanie komórek. Utrzymuj komórki LN na lodzie przez cały czas przetwarzania, aż do czasu hodowli.
- Umyć dwukrotnie, odwirować przy 393 x g przez 5 min. Po drugim płukaniu ponownie zawieś komórki LN w pożywce z limfocytów T (TCM). TCM zawiera RPMI z 10% inaktywowanym termicznie FBS, 292 μg/ml L-glutaminy, 110 μg/ml pirogronianu sodu oraz 55 μM 2-merkaptoetanolu i paciorkowca piórowego. Zazwyczaj stosuje się objętość 5 ml TCM na mysz dawcy.
- Policz komórki LN. Oczekiwana wydajność wynosi około 3-6 x 107 komórek LN na uodpornionego dawcę myszy.
- Skonfiguruj kultury polaryzujące do transferu adopcyjnego.
- Przygotuj kulturę polaryzacyjną Th17 składającą się z 5 x 106 komórek LN na ml z 10 μg / ml Ag, 20 ng / ml rekombinowanej mysiej interleukiny (IL)-23 i 10 ng / ml rekombinowanej myszy IL-6 w TCM.
- Alternatywnie, w przypadku polaryzacji Th1, przygotuj hodowlę 5 x 106 komórek LN na ml z 10 μg / ml Ag i 10 ng / ml rekombinowanej myszy IL-12 w TCM.
- Dodać 2 ml (1 x 107 komórek) na dołek polaryzującej mieszaniny kultur do 12-dołkowej płytki. Komórki LN od 2-4 myszy dawców wypełnią jedną 12-dołkową płytkę. Utrzymuj kultury w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 72 godziny.
- Sprawdź wzrokowo komórki LN w hodowli pod kątem aktywacji po 48 i 72 godzinach. Aktywowane komórki utworzą rozległe skupiska, a limfocyty T zwiększą swoją wielkość, stając się bardziej pleomorficzne. Wzrost metabolizmu spowoduje obniżenie pH w pożywce, zmieniając kolor z brzoskwiniowego na pomarańczowy. Jeśli pH jest wystarczająco niskie, aby zmienić kolor pożywki na żółty, dodaj 1 ml świeżego TCM, aby zapobiec toksyczności dla komórek w ciągu pozostałych 24 godzin.
- Przejdź do przeniesienia adopcyjnego.
3. Adoptywny transfer patogennych limfocytów T specyficznych dla AQP4
UWAGA: Ten krok wynika z Sekcji 2.5: Hodowla limfocytów T i prozapalna polaryzacja limfocytów T.
- Odzyskaj spolaryzowane komórki z płytek 12-dołkowych, pipetując w górę iw dół w celu usunięcia i przenosząc je do probówki o pojemności 50 ml. Przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
- Policz komórki, umyj je dwukrotnie w zimnym PBS i przygotuj zawiesinę 1 x 108 komórek/ml w PBS. Ogólnie rzecz biorąc, wstrzyknij komórki w ciągu godziny.
- Delikatnie wymieszać komórki, obracając je i przenieść do strzykawki o pojemności 1 ml w momencie wstrzyknięcia. Podawać 200 μl komórek (2 x 107) dożylnie (dożylnie) każdej myszy przez żyłę ogonową.
- Wstrzyknąć każdej myszy biorcy i.p. 200 ng toksyny B. pertussis rozcieńczonej w 200 μl PBS tego dnia i 2 dni później. Codziennie monitoruj myszy pod kątem oznak klinicznej choroby.
