Barwienie immunofluorescencyjne populacji neuronów w embrionalnym mysim przewodzie pokarmowym

Streszczenie

Źródło: Barlow-Anacker, A. J., et al., Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film demonstruje barwienie immunologiczne embrionalnego mysiego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji i analizy rozmieszczenia populacji neuronów za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Protokół barwienia immunologicznego

1. Jeśli próbki były przechowywane w 30% sacharozy, przepłucz je 3 razy przez 20 minut w 1x PBS na platformie bujanej.
2. Umieść odcinki przewodu pokarmowego w roztworze blokującym na platformie bujanej na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć roztwór blokujący i inkubować drogi pokarmowe z odpowiednią ilością przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej. Stosować rozcieńczenie 1:1,000 ludzkiego przeciwciała anty-Hu (surowica uzyskana od pacjenta), rozcieńczenie 1:1,000 przeciwciała przeciwko białku zielonej fluorescencji (GFP) kurczaka i rozcieńczenie 1:100 koziego przeciwciała anty-ChAT.
   nuta: Wykorzystujemy ludzkie przeciwciało anty-Hu, które zostało uzyskane miejscowo od pacjenta; jednak przeciwciała anty-Hu są dostępne w handlu, na przykład mysie przeciwciała anty-Hu (stosować w rozcieńczeniu 1:500).
4. Płucz przewód pokarmowy w 1x PBS 3 razy przez 5 minut, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze RT na bujanej platformie.
5. Zastąp 1x PBS przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w stosunku 1:500 w roztworze blokującym na platformie kołyszącej przez 4 godziny w temperaturze RT lub O/N w temperaturze 4 °C. Użyj barwnika anty-ludzkiego przeciw-ludzkiego reagującego z aminami, takiego jak Dylight, osła anty-kurczak Cy2 i ośła anty-koza Cy5. Jeśli używasz mysiego przeciwciała anty-Hu, użyj rozcieńczenia 1:500 barwnika anty-mysiego reagującego z aminami 405,
   nuta: Intensywność endogennej ekspresji GFP i tdTomato oraz klarowność barwienia immunologicznego wzrastają wraz z wiekiem rozwojowym. Zazwyczaj barwiemy immunologicznie jelita embrionalne pojedynczo w probówkach o pojemności 0,2 ml ze 150 μl roztworu barwiącego, aby zmniejszyć objętość użytego przeciwciała, a także zapewnić skuteczne barwienie tkanki.
6. Płucz przewód pokarmowy w 1x PBS 3 razy przez 5 minut, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze RT na bujanej platformie.
7. Umieść kilka kropli fluorescencyjnego podłoża montażowego z DAPI na szklanym szkiełku. Zanurz przewód pokarmowy w pożywce do montażu fluorescencji i dodaj szkło nakrywkowe bezpośrednio na chusteczkę. Fluorescencyjny nośnik montażowy -G jest rozpuszczalnym w wodzie związkiem, który zapewnia półtrwałe uszczelnienie.
   nuta: Użyj pożywki do montażu fluorescencji, takiej jak Vectashield, pożywki montażowej na bazie glicerolu, która zapobiega blaknięciu przeciwciał i fotowybielaniu. Oba te produkty umożliwiają przechowywanie tkanek przez długi czas w temperaturze 4 °C.
8. Uchwyć obrazy każdego fluoroforu za pomocą mikroskopu konfokalnego. Należy użyć długości fal wzbudzenia dla fluoroforów i filtrów zastosowanych w tabeli 1.
9. Wykonuj komputerową analizę obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania w zależności od typu konfokalnego używanego do przechwytywania obrazów.

Tabela 1: Długości fal wzbudzenia obrazowania konfokalnego, fluorofory i filtry. Przedstawiono długości fal wzbudzenia, wykrywalne fluorofory i zastosowane filtry. Informacje te można wykorzystać przy wyborze kombinacji przeciwciał drugorzędowych do immunofluorescencji wielobarwnej.

Wzbudzenie			Emisja
Linia laserowa	Typ fluoroforu	Przykłady	Rurka fotopowielacza	Opcje filtrowania
408 nm	niebieski	Alexa Fluor 405, Cascade Blue, Coumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, większość kropek kwantowych	1	BP 425-475 nm
488 nm	zielony	Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1	cyfra arabska	BP 500-550 nm
561 nm	czerwony	Alexa Fluor 546, 555, 568 i 594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, Fikoerytryna (PE), Jod propydyny (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC	3	Ciśnienie krwi 570-620 nm
638 nm	Daleki czerwony	Alexa Fluor 633 i 647, allofikocyjanina (APC), Cy5, TO-PRO-3	4	BP 663-738 nm

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Oxoid (Oxoid	BR0014G
Albumina surowicy bydlęcej	rybak	Zobacz materiał BP1605
Tryton X-100	Sigma	Silnik X100
Zakres fluorescencji	Nikon	Stereoskop SMZ-18
Probówki Eppendorfa 1,5 ml	Firma VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	Numer katalogowy: 0100-01
Szkiełka szklane	rybak	Numer katalogowy 12-550-15
Szkło nakrywkowe	Firma VWR	Numer katalogowy: 16004-330
Mikroskop konfokalny	Nikon	Nikon A1
Elementy firmy Nikon	Nikon

)