Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Model zwierzęcy
- Krzyżówka hemizygotycznych myszy Tg (Gfap-luc +/-) (myszy transgeniczne wykazujące ekspresję lucyferazy świetlika) z hemizygoycznymi myszami Tg (M83 +/-) (myszy transgeniczne eksprymujące ludzką alfa-synukleinę z rodzinną mutacją A53T) w celu wytworzenia hemizygotycznych bigenicznych myszy Tg (M83 +/-: Gfap -luc +/-).
- Genotyp potomstwa za pomocą reakcji łańcuchowej poliemerazy (PCR) w czasie rzeczywistym na obecność transgenu kodującego ludzką alfa-synukleinę oraz za pomocą standardowej PCR dla lucyferazy świetlika.
- Zaszczepić zwierzęta w wieku od sześciu do ośmiu tygodni.
2. Przygotowanie inokulum
- Przygotować monomeryczną rekombinowaną ludzką alfa-synukleinę z mutacją A53T w buforze soli fizjologicznej buforowanym trisem (TBS) zawierającym 150 mM NaCl w 20 mM Tris-HCl (pH 7,2).
- Przygotować fibrylarną alfa-synukleinę do inokulacji, mieszając 3 μg/μl monomerycznej rekombinowanej ludzkiej alfa-synukleiny w wytrząsarce orbitalnej przy 800 obr./min i temperaturze 37 °C przez 5 dni.
- Rozcieńczyć zespoły fibryli w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μg/μl do inokulacji dootrzewnowych.
- Fragmentuj fibryle alfa-synukleiny za pomocą sonikatora pręcikowego przez 1 minutę (40 impulsów o czasie trwania 0,5 s z jednosekundową przerwą między każdym impulsem i amplitudą ustawioną na 50%) na lodzie. Aby uniknąć zanieczyszczenia przez wysiew krzyżowy, należy użyć czystych sond sonicznych do przygotowania różnych inokulum.
3. Iniekcje dootrzewnowe
- W przypadku wstrzyknięć dootrzewnowych należy krótko narkotyzować zwierzęta w komorze anestezjologicznej poprzez inhalację izofluranem/tlenem, przy natężeniu przepływu 2 l/min i parowniku ustawionym na 2%. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie.
- Napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o pojemności 27 g 50 μl sonikowanych włókien alfa-synukleiny lub PBS.
- Należy wstrzykiwać bezpośrednio do otrzewnej myszy i unikać przenikania do jelita cienkiego lub jelita ślepego znajdującego się za ścianą jamy brzusznej, trzymając zwierzę w pozycji grzbietowej z głową skierowaną w kierunku przeciwnym do badacza i w dół pod kątem około 45°. Monitoruj zwierzęta, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia.
