1. Monitorowanie transkomórkowego rozprzestrzeniania się białek priopodobnych za pomocą obrazowania poklatkowego in vivo
UWAGA: Uprawiaj C. elegans typu dzikiego (WT) (N2) i linie transgeniczne zgodnie ze standardowymi metodami i dokładnie kontroluj temperaturę uprawy.
- Wygeneruj transgeniczne linie C. elegans eksprymujące białko podobne do prionów, oznaczone monomerycznym białkiem czerwonej fluorescencji (mRFP).
- Przygotuj zsynchronizowane populacje przez składanie jaj lub bielenie zgodnie ze standardowymi metodami.
- Synchronizacja przez składanie jaj
- Przełóż 10 - 20 ciężarnych dorosłych osobników na talerz i pozwól im składać jaja przez 1-2 godziny. Usuń dorosłe osobniki z talerza i pozwól potomstwu rosnąć do pożądanego wieku.
- Synchronizacja przez wybielanie
- Zbierz niezsynchronizowaną populację grawitacyjnych dorosłych osobników i wybiel je alkalicznym roztworem podchlorynu (250 mM wodorotlenku sodu (NaOH) i rozcieńczenie 1:4 (v/v) komercyjnego wybielacza w wodzie (H2O)). Umyć jaja dwukrotnie (218 x g przez 1 min) buforem M9 (21 mM Na2HPO4·7H2O (wodorofosforan disodu siedmiowodny), 22 mM (diwodorofosforan potasu) KH2PO4, 86 mM chlorek sodu (NaCl), 1 mM MgSO4·7H2O (siarczan magnezu siedmiowodny), dodać dH2O do 1 L).
- Pozwól im wykluć się w buforze M9 z delikatnym mieszaniem przez noc (O/N) w temperaturze 20 °C. Rozwój robaków zostanie zatrzymany na etapie L1 przy braku źródła pożywienia, pozostawiając zsynchronizowaną populację. Przenieś L1 na świeże płytki pożywki do wzrostu nicieni (NGM) wysiane bakteriami OP50 E. coli i pozwól potomstwu rozwijać się do pożądanego wieku.
- Przygotować 2% płatki agarozowe (w H2O) na szkiełku mikroskopowym zgodnie z opisem.
- Przygotuj dwa szkiełka mikroskopowe z taśmą opisową umieszczoną na całej ich długości, które będą używane jako przekładki. Umieść między nimi trzecie szkiełko mikroskopowe.
- Rozpuść 2% agarozy wH2Oi odpipetuj jedną kroplę na czysty szkiełku.
- Umieść czwarte szkiełko prostopadle do trzech pozostałych szkiełek na wierzchu kropli agaru. Delikatnie dociśnij, aby spłaszczyć podkładkę do tej samej grubości co taśma opisowa.
- Pozostaw do wyschnięcia na 1 minutę przed zdjęciem przekładek i delikatnym rozsunięciem prowadnic. Podkładka agarowa przyklei się do jednego z nich.
- Odpipetować ~10 μl środka znieczulającego (2 mM lewamizolu w buforze M9) do podkładki i przenieść ~10 zwierząt za pomocą platynowego drucianego patyka. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym (~22 x 22 mm) i zrób zdjęcia w ciągu 1 godziny.
- Alternatywnie, aby nabyć filmy przez dłuższy czas lub jeszcze bardziej zmniejszyć możliwość jakiegokolwiek ruchu zwierząt, należy zastosować kombinację znieczulenia i unieruchomienia kulek.
- Przygotować 10% płatki agarozowe (w buforze M9) zgodnie z opisem i dodać robaki do 3 μl roztworu wzorcowego wielkości nanosfery (kulki polistyrenu, 100 nm) plus 3 μl środka znieczulającego (4 mM lewamizol w buforze M9). Przykryj delikatnie szkiełkiem nakrywkowym. Aby uniknąć wysuszenia, uszczelnij szkiełko nakrywkowe VALAP (mieszanina równych ilości wazeliny, lanoliny i wosku parafinowego).
- Obraz unieruchomionych robaków za pomocą mikroskopu konfokalnego.
UWAGA: Wyniki uzyskuje się przy użyciu mikroskopu konfokalnego AF z wirującym dyskiem wyposażonego w kamerę EM-CCD oraz oprogramowanie do automatyzacji mikroskopii i analizy obrazu, takie jak MetaMorph, przedstawia szczegóły poniżej, ale można również zastosować inne porównywalne systemy obrazowania konfokalnego.
- Użyj obiektywu olejowego 63X lub 100X/1.4NA i umieść szkiełko mikroskopowe zawierające robaki w uchwycie szkiełka mikroskopu.
- Otwórz oprogramowanie. Dostosuj moc lasera i filtry do obrazowania mRFP. Użyj lasera 561 nm przy 10% mocy i filtrze emisyjnym >600 nm.
- Otwórz "Akwizycja wielowymiarowa". W zakładce "Główne" zaznacz pola "Timelapse" i "Run Journals" (sprzętowy autofokus: wyłączony).
- Na karcie "Zapisywanie" wybierz lub utwórz folder katalogu, w którym pliki mają zostać zapisane. Przypisz nazwę do pliku.
- W zakładce "Długość fali" wybierz odpowiednie oświetlenie i dostosuj ekspozycję i wzmocnienie. Użyj "YokoQuad Red" (lub równoważnego ustawienia oświetlenia dla obrazowania mRFP) z ekspozycją od 100 do 300 ms i wzmocnieniem kamery od 100 do 300, w zależności od indywidualnej próbki (ocenianej przy użyciu obrazu na żywo).
- W zakładce "Timelapse" wybierz "Liczba punktów czasowych" = 301, "Czas trwania" = 5 minut i "Czas/interwał" = 1 sek.
- W zakładce "Dzienniki" wybierz Dziennik: "AFC SET Z HOLD" i "AFC Return to Z HOLD", wpisz: "Special" (dwukrotnie), Punkt początkowy: "Początek punktu czasowego" i "Koniec punktu czasowego". Ta opcja autofokusa jest ważna, aby obrazować ten sam fragment przez dłuższy czas.
- Po zakończeniu konfiguracji naciśnij "Pobierz". Film poklatkowy jest zapisywany jako osobne pliki TIFF.
