Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Produkcja i oczyszczanie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV)
Uwaga: produkcja i oczyszczanie wektora rAAV zostały przeprowadzone przez Leuven Viral Vector Core (LVVC).
- Krótko mówiąc, transfekcyjne subkonfluentne komórki HEK 293T o niskim (<50) pasażowaniu przy użyciu liniowego roztworu transfekcji 25 kD z polietylenu 150 nM NaCl i trzech różnych plazmidów w stosunku 1: 1: 1 w pożywce DMEM 2% płodowej surowicy bydlęcej. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C w 5% CO2 należy zastąpić pożywkę świeżą pożywką DMEM 2% płodowej surowicy bydlęcej.
nuta: Plazmidy obejmują konstrukty serotypu AAV7, plazmid transferowy AAV kodujący ludzką zmutowaną alfa-synukleinę A53T (α-SYN) pod kontrolą promotora synapsyny wzmocnionej CMVie oraz plazmid pomocniczy adenowirusa pAdvDeltaF6.
- Zebrać pożywkę 5 dni po transfekcji przejściowej i zagęścić za pomocą filtracji o przepływie stycznym.
- Oczyść cząstki wektora rAAV ze stężonego podłoża za pomocą gradientu krokowego jodiksanolu.
- Używaj standardowych technik PCR w czasie rzeczywistym do oznaczania kopii genomu (GC). W tym protokole miano wektora 3,0 E11 GC/ml wykorzystano do opracowania szczurzego modelu choroby Parkinsona (PD) opartego na α-SYN.
2. Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora rAAV α-SYN w istocie czarnej (SN) szczura (Rysunek 1)
- Trzymaj w domu ośmiotygodniowe samice szczurów rasy Wistar o wadze około 200-250 g w normalnym 12-godzinnym cyklu światła/ciemności ze swobodnym dostępem do granulowanego pokarmu i wody z kranu.
- Poddać szczura znieczuleniu dootrzewnowemu (i.p.) zawierającemu mieszaninę ketaminy (60 mg/kg) i medetomidyny (0,4 mg/kg). Gdy szczur jest znieczulony i nie reaguje na ściskanie różnych łap, podaj mikrotransponder podskórnie na grzbiecie szczura w celu dalszego rozpoznania za pomocą implantatora mikrotranspondera. Sprawdź, czy mikrotransponder jest prawidłowo ustawiony i czy może być odczytany przez urządzenie odczytujące.
- Obetnij włosy na skórze głowy. Nałóż znieczulenie miejscowe zarówno na skórę głowy, jak i uszy. Resztę zabiegu chirurgicznego należy wykonać przy przepływie laminarnym przy użyciu technik aseptycznych.
- Umieść szczury w stereotaktycznej ramie głowy za pomocą dwóch nauszników, ust i paska na nos. Przykryj ciało szczura papierowym kocem, aby uniknąć spadku temperatury ciała. Zastosuj lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
- Zdezynfekuj skórę głowy jodem 1% w izopropanolu 70% i wykonaj małe nacięcie w linii środkowej skóry głowy. Delikatnie zeskrob błony na czaszce i spłucz solą fizjologiczną. Pozostaw czaszkę do wyschnięcia na kilka minut. Obserwuj szwy czaszkowe i dwa punkty odniesienia: Bregma i Lambda.
- Aby wstrzyknąć wektor rAAV do SN, zdefiniuj współrzędne w kierunku Bregmy (przednio-tylne: 5,3 mm; przyśrodkowo-boczne: 2,0 mm; i grzbietowo-brzuszne: 7,2 mm liczone od opony twardej).
nuta: Trójwymiarowe współrzędne dla każdego obszaru zainteresowania można obliczyć za pomocą stereotaktycznego atlasu mózgu szczura, stosując Bregmę jako anatomiczny punkt odniesienia.
- Napełnij strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 10 μl (20 mm w rozmiarze 30) wektorem rAAV i umieść ją w przyrządzie stereotaktycznym podłączonym do zmotoryzowanej pompy do mikroiniekcji. Kontroluj objętość, uwalniając kroplę wektora i wyeliminuj w wielowartościowym detergencie czyszczącym pH 9 (np. RBS).
- Sprawdź wzrokowo, czy głowica jest zamocowana prosto w ramie głowicy i oceń oś lewo-prawo. Dokładnie określ wizualnie współrzędne przednio-tylne i przyśrodkowe dla Bregmy i Lambdy i zmierz ich wysokość za pomocą igły o rozmiarze 30 mm 20 mm w grzbietowo-brzusznym ramieniu ramy stereotaktycznej.
- Dopuszczaj maksymalnie 0,3 mm różnicy wysokości między Bregmą a Lambdą. Umieść igłę z powrotem na Bregmie i zastosuj współrzędne przednio-tylne i przyśrodkowe, przesuwając przednio-tylne i przyśrodkowe ramię ramy stereotaktycznej.
- W miejscu wstrzyknięcia należy zmierzyć wysokość czaszki i upewnić się, że nie różni się ona o więcej niż 0,3 mm od wysokości leku Bregma. Wywierć otwór w czaszce o średnicy około 2 mm. Zmierz wysokość opony twardej, która posłuży jako odniesienie do zastosowania współrzędnej grzbietowo-brzusznej. Alternatywnie odejmij ustaloną grubość czaszki (0,9 mm).
- Przeniknąć do opony twardej za pomocą igły o rozmiarze 26 i wchłonąć krew za pomocą sterylnej tkanki. Poczekaj, aż całe krwawienie ustanie, zanim przejdziesz dalej.
- Powoli wprowadzić strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 10 μl z roztworem wektorowym do mózgu na wcześniej ustaloną głębokość (współrzędna grzbietowo-brzuszna). Odczekaj 1 minutę z włożoną igłą. Wstrzyknąć 3 μl roztworu wektora (3,0 kopii genomu E11/ml (średnia dawka wektora) lub 1,0 E12 GC/ml (wysoka dawka wektorowa) wektora kontrolnego rAAV2/7 α-SYN lub eGFP) za pomocą zmotoryzowanej pompy do mikroiniekcji o przepustowości 0,25 μl/min.
- Po wstrzyknięciu należy przytrzymać igłę na miejscu przez kolejne 5 minut, a następnie powoli ją wyjąć. Zszyj skórę głowy za pomocą powlekanego plecionego poliestru 3.0, zdezynfekuj 1% jodem w 70% izopropanolu i delikatnie wyjmij zwierzę z instrumentu stereotaktycznego. Najpierw poluzuj pasek na nos i usta, a następnie dwa nauszniki.
- Aby odwrócić znieczulenie, wstrzyknąć szczurowi dootrzewnowo 0,5 mg/kg atipamezolu i umieścić szczura w czystej klatce na płycie grzewczej o temperaturze 38 °C, aż się obudzi. Przykryj szczura papierowym kocem, aby zapobiec spadkowi temperatury ciała.
- Zapewnij łatwy dostęp do jedzenia i wody przez pierwsze godziny. Monitoruj szczura przez pierwsze kilka dni. W razie potrzeby zastosuj analgesia.
nuta: Nie ma potrzeby zdejmowania szwów z czaszki. Po 1-2 tygodniach czaszka jest całkowicie naprawiona, a szwy się poluzowują.
