Izolacja nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej

Streszczenie

Źródło: Diner, I., et al. Wzbogacenie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film wyjaśnia proces izolowania i wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z zamrożonej pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Demonstruje kluczowe etapy, w tym homogenizację, obróbkę detergentami, sonikację i ultrawirowanie w celu oddzielenia i oczyszczenia nierozpuszczalnych agregatów. Ostatnim etapem jest solubilizacja agregatów w buforze mocznikowym w celu dalszej analizy.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Homogenizacja i frakcjonowanie

1. Selekcja tkanek
   UWAGA: Wybrano zamrożoną pośmiertną tkankę kory czołowej ze zdrowej grupy kontrolnej (Ctl) i patologicznie potwierdzonych przypadków AD (n = 2). Pośmiertną ocenę neuropatologiczną rozmieszczenia blaszek amyloidowych przeprowadzono zgodnie z półilościowymi kryteriami punktacji Konsorcjum na rzecz Ustanowienia Rejestru Choroby Alzheimera, chociaż patologię splątania neurofibrylarnego oceniono zgodnie z systemem oceny stopnia zaawansowania Braaka.
   1. Uzyskaj zamrożoną pośmiertną tkankę mózgową od zdrowej grupy kontrolnej (Ctl) i patologicznie potwierdzonych przypadków AD. Wykorzystując pojemniki z suchym lodem, kleszcze i żyletkę, wyciąć ~ 250 mg porcji istoty szarej z każdej próbki tkanki na tarowanych jednorazowych łodziach wagowych, uważając, aby zapobiec rozmrożeniu tkanki. Zapisać masę każdego kawałka, który ma być homogenizowany.
   2. Wyciąć ~ 250 mg istoty szarej za pomocą kleszczy i brzytwy, dokonując oględzin w celu zlokalizowania granicy faz między zewnętrzną istotą szarą a wewnętrzną istotą białą. Unikaj istoty białej, a co ważniejsze, wszelkich dużych naczyń krwionośnych lub krwawych obszarów, opon mózgowych lub pajęczynówki. Utrzymuj tkankę zamrożoną podczas procesu cięcia, pracując szybko i często, umieszczając łódkę wagową z tkanką mózgową w polistyrenowych pojemnikach z suchym lodem.
   3. Zapisać dokładną masę istoty szarej wyciętej z każdego zamrożonego kawałka za pomocą wagi analitycznej. Obliczyć objętość buforu o niskiej zawartości soli (LS) (patrz Tabela 1) potrzebnego do homogenizacji z beczki (5 ml/g lub 20% w/v).
   4. Przygotuj 10 ml buforu LS z 1x koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy i schłodź na lodzie.
   5. Wyjmij zważoną chusteczkę i łódkę wagową z suchego lodu i pokrój w kostkę na kawałki o wymiarach około 2 x 2 mm podczas rozmrażania. Przenieść do 2 ml wstępnie schłodzonej probówki homogenizatora z beczki na lodzie.
   6. Dodaj 5 ml / g (20% w/v) lodowatego buforu o niskiej zawartości soli (LS) z koktajlem 1X inhibitorów proteazy i fosfatazy.
   7. Homogenizuj tkankę mózgową na lodzie za pomocą około 10 uderzeń tłuczka A o wysokim prześwicie i 15 uderzeń tłuczka B o niskim prześwicie.
   8. Przenieść cały homogenat do probówki polipropylenowej o pojemności 2 ml za pomocą szklanej pipety Pasteura. Oznacz probówkę symbolem "TH" (Total Homogenate), numerem tkanki i objętością homogenatu. Podajmy 0,8 ml do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml. Nadmiar homogenatu może być podobnie podzielony i przechowywany w temperaturze -80 °C.
   9. Do każdej podwielokrotności 0,8 ml dodać po 100 μl 5 M NaCl i 10% (w/v) sarkozylu do stężeń odpowiednio 0,5 M i 1% w/v. Dobrze wymieszaj probówki przez odwrócenie i inkubuj na lodzie przez 15 minut. Oznaczyć probówki symbolem "TH-S" (Total Homogenate-Sarkosyl), aby wskazać, że homogenaty znajdują się w buforze sarkozylu (Tabela 1).
   10. Sonikuj każdą probówkę przez trzy 5-sekundowe impulsy o amplitudzie 30% na lodzie (maksymalna intensywność = 40%) za pomocą sondy z mikrokońcówką.
   11. Oznaczyć stężenia białek w homogenatach przy użyciu metody oznaczania kwasu bicinchoninowego (BCA).
       nuta: Średnie stężenie białka w homogenatach TH-S przygotowanych w stężeniu 5 ml LS na gram tkanki wynosi 15-20 mg/ml. Homogenaty mogą być natychmiast frakcjonowane lub przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
   12. Rozcieńczyć homogenaty TH-S do 10 mg / ml za pomocą lodowatego buforu Sark (Tabela 1) z 1x inhibitorami proteazy i fosfatazy.
   13. Przenieść 5 mg białka (0,5 ml) z każdego homogenatu TH-S do probówek ultrawirówek z poliwęglanu o pojemności 500 μl i zrównoważyć parami za pomocą buforu sark. Załadować probówki do wstępnie schłodzonego rotora i ultrawirować przy 180 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść rozpuszczalne w sarkozylu supernatanty (S1) do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
       UWAGA: (Opcjonalne mycie) Dodać 200 μl buforu sark do probówek ultrawirówek zawierających frakcje nierozpuszczalne w detergentach (P1) i usunąć granulki (P1) z dna probówek ultrawirówek za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
   14. Krótko wiruj pulsacyjnie odwrócone probówki przez 2-3 s (≤2,500 x g) na mikrowirówce, aby przenieść granulki (P1) i bufor do probówek o pojemności 1,5 ml poniżej. Zawiesić nierozpuszczalne granulki (P1) w buforze sark, pipetując w górę i w dół, aby upewnić się, że osad został rozerwany.
   15. Zrównoważyć parami i odwirować przy 180 000 x g przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 4 °C.
   16. Odrzucić opcjonalny supernatant do przemywania (S2) i inkubować nierozpuszczalne w sarkozylu granulki (P2) w 50-75 μl buforu mocznikowego (Tabela 1) z 1x (koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu rozpuszczenia osadu.
       nuta: Przed użyciem podgrzej bufor mocznikowy do temperatury pokojowej, aby uniknąć wytrącania się SDS. W przypadku zastosowań wrażliwych na detergenty należy pominąć SDS w buforze mocznikowym i rozważyć umycie nierozpuszczalnego osadu (P2) w buforze o niskiej zawartości soli przed ponownym zawieszeniem w buforze mocznikowym.
   17. Przenieś zawieszone granulki (P2) do probówek o pojemności 0,5 ml i użyj krótkiej (1 s) sonikacji mikrokońcówek o amplitudzie 20% (maksymalna intensywność = 40%), aby w pełni rozpuszczono granulki.
   18. Oznaczyć stężenia białek we frakcjach rozpuszczalnych w sarkozylu (S1) i nierozpuszczalnych (P2) przy użyciu metody oznaczania BCA. Frakcje te należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

Tabela 1: Lista

10% w/v roztwór sarkozylu: 10 g soli sodowej N-laurylo-sarkozyny na 100 ml ddH2O (mieszać w temperaturze pokojowej przez noc)

Bufor o niskiej zawartości soli (LS): 50 mM HEPES pH 7,0, 250 mM sacharozy, 1 mM EDTA

Bufor sarkozylowy (sark): bufor LS + 1% (w/v) sarkozyl + 0,5 M NaCl

Bufor mocznikowy (przechowywać w temperaturze -20 °C): 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 8M mocznik, 2% SDS

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy, wolny od EDTA (100X)	Rybak termiczny	Numer telefonu 78441	Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy
System dysmembratora sonicznego (ultradźwięki)	Fisher Naukowy	FB505110	Ultradźwiękowiec z mikrokońcówką
Ultrawirówka Optimax TLX	Beckman Coulter	361545	Ultrawirówka z chłodzeniem
Wirnik TLA120.1	Beckman Coulter	362224	wirnik ultrawirówkowy
Rury poliwęglanowe 500 ul (8x34mm), grubościenne	Beckman Coulter	343776	probówki ultrawirówkowe do wirnika TLA120.1
Sól sodowa N-lauroilosarkozyny (sarkozyl)	Sigma Aldrich	L5777-50G	Detergent
1,5 ml polipropylenowy tłuczek do granulek	Pościg Kimble'a	Nr kat. 749521-1500	Narzędzie do homogenizacji
Silnik akumulatorowy do tłuczka do pelletu	Pościg Kimble'a	Nr kat. 749540-0000	Narzędzie do homogenizacji