Ocena funkcji motorycznych w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia nerwu

Abstract

Źródło: Gonsalvez, D. G., et al., Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 do oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film pokazuje proces oceny dysfunkcji motorycznej w modelu mysim poprzez podanie toksyny krztuścowej i inokulum zawierającego peptydy naśladujące mielinę i adiuwanty, a następnie testy na bieżni w celu oceny funkcji motorycznych i oceny wynikłego uszkodzenia nerwów w wyniku aktywacji immunologicznej i demielinizacji.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Indukcja EAN (eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie nerwu)

UWAGA: EAN może być skutecznie indukowany u samców myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni. Protokół indukcji trwa łącznie 9 dni. Dzień 0 odnosi się do dnia pierwszego szczepienia. W przypadku tego protokołu zastrzyki przeprowadzano w znieczuleniu (patrz krok 1.1.2 poniżej).

1. W dniu -1:
   1. Przygotować roztwór toksyny krztuścowej (patrz tabela materiałów) o stężeniu 1,6 μg/ml, używając sterylnego 0,1 M roztworu soli fizjologicznej buforowanej izotonicznym fosforanem myszy (MT-PBS).
   2. Znieczulenie izofluranem:
      1. Umieść mysz (C57BL/6, samiec, 6-8 tygodni) w komorze anestezjologicznej i dostosuj przepływ tlenu do 1 l/min.
      2. Włącz waporyzator izofluranu, ustaw go na 2,5% w celu znieczulenia, monitoruj oddech i poczekaj 2 minuty lub do momentu, gdy odruchy pierwotne (rogówka i kończyna tylna) przestaną reagować.
   3. Wyjmij mysz z komory anestezjologicznej i podaj 250 μl powyższego roztworu toksyny krztuścowej we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.) za pomocą strzykawki 0,5 ml z igłą 30_1/2 G.
   4. Przygotować inokulum do wstrzykiwań do immunizacji:
      1. Przygotować roztwór A, używając 2 mg/ml roztworu peptydu P0180-199 (o czystości > 98%, sekwencja S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) w 0,9% soli fizjologicznej.
      2. Przygotować roztwór B, używając 20 mg/ml roztworu Mycobacterium tuberculosis (patrz tabela materiałów) w kompletnym adiuwantzie Freunda (FCA, składającym się z 15% monoolanu mannidu + 85% oleju parafinowego i 0,5 mg/ml wysuszonego zabitego i wysuszonego Mycobacterium butyricum).
      3. Aby przygotować końcowe inokulum do wstrzykiwań, należy połączyć równe objętościowo części roztworów A i B w ubijaku do kulek i mieszać je z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
         nuta: Roztwory A i B mogą być przechowywane w zapasie i w temperaturze 4 °C przez maksymalnie jeden miesiąc, ale połączone inokulum końcowe musi być świeżo przygotowane w dniu wstrzyknięcia u myszy.
2. W dniu 0 należy podać 50 μl inokulum (preparat opisany w kroku 1.1.4) myszowi poprzez wstrzyknięcie podskórne za pomocą igły 23 G.
   nuta: Wstrzyknięcie można umieścić między łopatkami lub między kończyną tylną a ogonem nad grzbietem ogonowym.
3. W dniu 1 przygotuj roztwór toksyny krztuścowej o stężeniu 1,2 μg/ml (w MT-PBS) i podaj 250 μl myszy przez wstrzyknięcie dożylne za pomocą strzykawki 0,5 ml z igłą 301/2 G.
4. W dniu 3 powtórz krok 1.3 powyżej.
   nuta: Roztwory podstawowe A i B mogą być sporządzane i przechowywane w temperaturze 4 °C maksymalnie przez jeden miesiąc. Jednakże końcowe inokulum do wstrzykiwań, wytworzone przez połączenie roztworów podstawowych A i B, musi być wykonane w dniu wstrzyknięcia.
5. W dniu 8 należy podać 50 μl inokulum (preparat opisany w kroku 1.1.4) myszowi poprzez wstrzyknięcie podskórne (patrz krok 1.2 powyżej) w to samo miejsce wstrzyknięcia, co w kroku 1.2 (dla każdego zwierzęcia)

2. Ocena funkcji motorycznych

UWAGA: Sprawność motoryczna jest oceniana równolegle z punktacją kliniczną dla tej samej kohorty zwierząt. Aparatura do oceny funkcji motorycznych musi być podłączona do komputera, który ma zainstalowany system obrazowania funkcji chodu (patrz tabela materiałów). Zaleca się również, aby wszystkie myszy, które mają być oceniane, były przyzwyczajone do zadania biegowego przed indukcją EAN. W tym celu przeprowadza się ćwiczenia (2 testy na mysz) na trzy dni przed indukcją choroby (dzień -3).

1. Włączyć aparaturę do oceny funkcji motorycznych i włączyć przycisk światła.
2. Mocno chrap mysz i posmaruj jej stopy, opuszczając ją na pojemnik wypełniony czerwonym atramentem, trzymając ją za ogon.
   nuta: Ten krok jest wymagany w przypadku szczepu C57BL/6, ale można go pominąć, jeśli używany jest szczep myszy o białym kolorze sierści.
3. Umieść mysz w komorze do chodzenia i ustaw prędkość bieżni na 15 cm/s.
4. Włącz bieżnię i kliknij przycisk "nagraj", aby uchwycić ruch biegowy myszy za pomocą systemu obrazowania funkcji chodu (patrz tabela materiałów).
5. Użyj timera i mierz każdy bieg przez 36 sekund. Po 36 s przerwij nagrywanie i zatrzymaj bieżnię.
   nuta: Myszy, które nie mogą pomyślnie ukończyć uruchomionego zadania w tym 36-sekundowym interwale, są uważane za nieudane.
6. Zapisz plik wideo w wyznaczonym folderze.
7. Powtórz powyższe kroki dla każdej myszy, która ma zostać oceniona. Testuj myszy z tym samym uruchomionym zadaniem co 3 dni.
8. Przeanalizuj edytowane pliki wideo za pomocą oprogramowania do pomiaru parametrów funkcji chodu (patrz tabela materiałów).
   nuta: Szczegóły dotyczące analizy różnych parametrów silnika różnią się w zależności od oprogramowania, dlatego przed analizą należy zapoznać się z instrukcjami producenta. W zależności od konkretnych celów badań, tkanki zwierzęce mogą być pobierane na dowolnym etapie oceny funkcji postmotorycznych w celu uzyskania histologicznych dowodów uszkodzenia aksonów i mieliny za pomocą immunohistochemii lub mikroskopii elektronowej.

Results

Tabela 1: Paradygmat wyników klinicznych EAN.

wynik	Kryteria	Uwagi i uwagi dotyczące kryteriów oceniania
0	Normalna mysz
1	Mniej żywy LUB pieniący się	Ocenia się to w odpowiedzi n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, piesek, 6-8 tygodni	Australijskie zasoby biologiczne Cenre, WA, Australia
Toksyna krztuścowa	Lista Biological Laboratories, Inc., CA, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy #181
0.1M mysia izotoniczna fosforanowana buforowana sól fizjologiczna (MT-PBS)			Laboratoria będą miały swój własny protokół.
Izofluran	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratoria będą miały swój własny protokół podawania.
Peptyd P0180–199	Wuxi Nordisk Biotech Co. Porucznik SHG, CHN		P0180–199, sekwencja S–S–K–R–G–R–Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Ciepło zabiło Mycobacterium tuberculosis (szczep H37RA)	Difco, Michigan, Stany Zjednoczone	#231141
Kompletny adiuwant Freunda (FCA)	Difco, Michigan, Stany Zjednoczone	#263910
16% paraformaldehyd (PFA)	Usługi w zakresie mikroskopii elektronowej	Numer katalogowy #15710	Rozcieńczyć do 4% PFA w dniu pobrania tkanki.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Rozcieńczyć do 2,5% aldehydu glutarowego w dniu utrwalenia.
Azydek sodu	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	Zobacz materiał SL189	Twórz 10% (w/v) zapasów w 0,1 mln MT-PBS. Stosować w stężeniu 0,03% (v/v).
sacharoza	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	Zobacz materiał SA030	Stosować przy 30% (w/v).
Optymalna temperatura skrawania (OCT) medium	Sakura Finetek, Kalifornia, Stany Zjednoczone	#4583
Normalna surowica osła	Merck Millipore, Massachusetts, Stany Zjednoczone	#S30-100	Stosować jako rozcieńczalnik przeciwciał o stężeniu 10% (v/v) lub innym określonym przez własne laboratorium.
Tryton-X 100	Sigma Aldrich, Michigan, Stany Zjednoczone	#90o2-31-1	Stosować w rozcieńczalniku przeciwciał o stężeniu 0,3% (v/v) lub innym określonym przez własne laboratorium.
Królicze białko prekursorowe antyamyloidu (APP)	Invitrogen (Life Technologies), Kalifornia, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał S12700	Używany w skali 1:400 lub miareczkowany we własnym laboratorium.
Białko związane z antykontaktyną królika-1 (Caspr)	Prezent od prof. Eliora Pelesa, Instytut Naukowy Wiezmanna, Izrael		Używany w skali 1:500 lub miareczkowany we własnym laboratorium.
Odpowiednie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor	Sondy molekularne (Life Technologies), Oregon, Stany Zjednoczone	rozmaity	Stosować w stosunku 1:200 lub miareczkować we własnym laboratorium. Wybór gatunku, w którym wyhodowano przeciwciało, i wybór Alexa Fluor zależy od uznania każdego laboratorium.
Wodne rozwiązanie montażowe	Dako (Agilent), CA, Stany Zjednoczone	#S3023	Każde laboratorium będzie miało swoje własne preferencje.
sprzęt
Strzykawka 0,5 ml z igłami 301/2 g	Bd	#326105
Igły 23 g	Bd	#305143
Poduszka z czerwonym atramentem			Do oznaczenia łap zwierząt można użyć dowolnej czerwonej poduszki z atramentem lub czerwonego barwnika spożywczego.
Aparatura DigiGate (w tym bieżnia)	eMouse Specifics Inc. Framingham, Massachusetts
System obrazowania DigiGate	eMouse Specifics Inc. Framingham, Massachusetts
stoper			Można użyć dowolnego timera.
Oprogramowanie DigiGait 8	eMouse Specifics Inc. Framingham, Massachusetts
Mikroskop preparacyjny	Zeiss		Można użyć odpowiedniego mikroskopu preparacyjnego.
Ładowane zjeżdżalnie	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Księga Leica		Można użyć dowolnego odpowiedniego cyrostatu.
Sprzęt perfuzyjny i narzędzia prosektoryjne			Laboratoria będą miały swoje własne protoktole perfuzyjne.
Nieprzezroczysta komora humifikowa			Laboratoria mogą produkować własne przy użyciu nieprzezroczystego plastikowego pojemnika.
Długopis PAP	GeneTex (Stany Zjednoczone)		Wosk, ołówek lub napięcie powierzchniowe mogą być również użyte do stworzenia dołka wokół sekcji tkanki.
Mikroskop konfokalny	Zeis LSM780		Można użyć dowolnego mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi liniami laserowymi.
FIDŻI/Obraz J	Krajowe Instytuty Zdrowia		Dostępne od www.fiji.sc