1. Sprzężenie ekspresji transgenu Htt za pośrednictwem Gal4 i QF u Drosophila
- Zbieraj i/lub generuj transgeniczne linie Drosophila melanogaster zawierające specyficzne tkankowo "sterowniki" Gal4 lub QF, a także linie zawierające transgeny Htt typu dzikiego lub zmutowanego poniżej Gal4-UAS lub QF-QUAS. Upewnij się, że białka, które ulegają ekspresji z tych transgenów, są połączone z białkami fluorescencyjnymi lub znakowane epitopami, aby umożliwić różnicowanie zmutowanych i dzikich produktów transgenu Htt w tej samej muszce. Patrz rysunek 1.
UWAGA: Zazwyczaj używamy fragmentów eksonu 1 ludzkiego genu Htt. Jednak zamiast tego można wygenerować muchy transgeniczne w celu ekspresji dłuższych fragmentów Htt lub innych genów, jeśli jest to pożądane.
- Zaplanuj strategię genetyczną w taki sposób, aby zmutowane i dzikie transgeny Htt ulegały ekspresji w odrębnych, nienakładających się na siebie populacjach komórek.
- Jeśli dojdzie do nakładania się ekspresji, zmutowane i dzikie białka Htt zsyntetyzowane w tych samych komórkach będą się koagregować i zapobiegać wykrywaniu zdarzeń podobnych do prionów. Aby tego uniknąć, należy użyć represorów specyficznych dla Gal4 i QF, odpowiednio Gal80 i QS40 (rysunek 1). Wybór kontrolowanych rozwojowo czynników Gal4 i/lub QF może pomóc w ograniczeniu ekspresji zmutowanego Htt do komórek postmitotycznych, eliminując możliwość, że podział komórki może przyczyniać się do rozprzestrzeniania się agregatów między komórkami.
- Korzystając ze standardowych warunków hodowli, połącz muchy, aby wygenerować potomstwo, które wyraża zmutowany Htt poprzez QF (lub Gal4) w populacji komórek "dawcy" i Htt typu dzikiego poprzez Gal4 (lub QF) w populacji komórek "biorcy". Na rysunku 1 przedstawiono schemat przedstawiający możliwą kombinację genetyczną.
nuta: Sterowniki QF i Gal4, które zostały użyte do wygenerowania danych pokazanych na rysunkach 1-4 i w naszej poprzedniej publikacji, obejmują sterownik neuronu receptora węchowego DA1 (ORN), Or67d-QF, oraz sterownik pan-glejowy, repo-Gal4.
- Generuj równolegle muchy kontrolne, które wyrażają Htt typu dzikiego zarówno w populacjach komórek znakowanych QF, jak i Gal4.
- Zebrać potomstwo o pożądanym genotypie i odpowiednio postarzać zwierzęta.
2. Mikropreparacja i fiksacja mózgów dorosłych Drosophila
UWAGA: Ta procedura preparacji została zmodyfikowana w stosunku do poprzedniej publikacji i może być użyta do przygotowania mózgów do obrazowania bezpośrednich sygnałów fluorescencyjnych z fuzji białek Htt-fluorescencyjnych.
- Zebrać następujące materiały i umieścić na lodzie: sól fizjologiczną buforowaną fosforanami zawierającą 0,03% Triton X-100 (PBS/T); probówki do mikrowirówek zawierające 970 μl 4% roztworu utrwalającego paraformaldehydu (PFA) przygotowanego przez dodanie 200 μL 20% PFA do 770 μL PBS/T; naczynie z przezroczystego szkła zawierające studzienkę; jednorazowa pipeta transferowa; dwa kleszcze preparacyjne (jeden nr 3 i jeden nr 5).
- Znieczulić dorosłe muchy za pomocą CO2 i przenieść je do jednej studzienki szklanego naczynia na lodzie.
- Za pomocą pipety transferowej dodać niewielką ilość (~ 500 μl) zimnego PBS/T do studzienki zawierającej muchy i do pustej studzienki. Unikaj wprowadzania zbyt wielu pęcherzyków, ponieważ mogą one zakłócać rozwarstwienie.
- Umieść szklane naczynie na płaskiej powierzchni pod mikroskopem preparacyjnym i dostosuj powiększenie, aż ciało muchy wypełni pole widzenia i będzie ostre.
- Ustaw parę źródeł światła na gęsiej szyi tak, aby światło oświetlało obie strony szklanego naczynia. Zakotwicz złożoną tkankę laboratoryjną pod szklanym naczyniem, aby usunąć części ciała/skórki podczas sekcji.
- Używając kleszczy nr 3 w ręce niedominującej, przenieś pojedynczą muchę do studzienki zawierającej PBS/T. Unieruchom muchę, chwytając ją za brzuch stroną brzuszną skierowaną do góry.
- Trzymając muchę całkowicie zanurzoną w PBS/T, zdejmij głowę muchy za pomocą kleszczy nr 5 w dominującej ręce. Włóż jedną końcówkę tych kleszczy pod naskórek w małej przestrzeni przylegającej do trąbki po jednej stronie głowicy muchy. Zabezpiecz uchwyt na głowie, ściskając kleszcze, aby chwycić oko z obu stron.
- Usuń głowę muchy z jej ciała, rozsuwając dwa kleszcze. Wyrzuć ciało muchy na tkankę laboratoryjną umieszczoną w pobliżu. Utrzymuj nacisk na kleszcze dominującej ręki, aby nie zgubić główki muchy.
- Umieść jedną końcówkę kleszczyków nr 3 w dłoni niedominującej w tej samej małej przestrzeni pod naskórkiem po drugiej stronie trąbki. Po ustawieniu ściśnij kleszcze, aby chwycić oczy w tym samym miejscu po obu stronach głowy.
- Gdy uchwyt na naskórku jest już pewny, delikatnie rozsuń kleszcze pod kątem 180°. To działanie rozbije naskórek głowy bez uszkodzenia mózgu. Wyrzuć resztki naskórka na tkankę laboratoryjną.
- Chociaż jest to idealne, naskórek głowy może nie zostać całkowicie usunięty w jednym kroku. W takim przypadku usuwaj naskórek kawałek po kawałku, aż mózg zostanie całkowicie odsłonięty. Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu, unikając bezpośredniego kontaktu z kleszczami.
- Wyjmij wypreparowany mózg z PBS/T, chwytając przyczepioną tchawicę lub zasysając mózg do przestrzeni między końcówkami kleszczy za pomocą działania kapilary.
nuta: Usuwanie tchawicy jest opcjonalne, ponieważ ma tendencję do zasłaniania płatów czułkowych na przedniej powierzchni mózgu, gdzie zwykle obrazujemy. Jeśli jednak tchawica zakłóca obrazowanie, usuń je ostrożnie, aby mózg nie został uszkodzony przez tę manipulację.
- Przenieś mózg muchy do jednej z probówek mikrowirówek zawierających roztwór utrwalający na lodzie. Upewnij się, że mózg odłącza się od kleszczy i jest zanurzony w roztworze utrwalającym.
- Gdy wszystkie mózgi zostaną wypreparowane, poddaj je "krótkiej naprawie", umieszczając zamknięte rurki na nutatorze na ~ 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
UWAGA: Ten krótki krok fiksacji zapewnia, że mózgi są łatwiejsze do przenoszenia w kolejnych krokach i nie przylegają do boków probówki mikrowirówkowej.
- Usunąć większość roztworu utrwalającego za pomocą pipety P1000 i wyrzucić go.
- Unikaj zasysania mózgów z rurki podczas tego i każdego kolejnego etapu prania. Ustaw P1000 na mniejszą objętość (np. 650 μl) i usuń supernatant w dwóch krokach. Ponadto trzymaj probówki mikrowirówek w jednej linii ze źródłem światła (np. światłami górnymi) podczas aspiracji, aby lepiej uwidocznić mózg.
- Dodaj 1 ml świeżego PBS/T do mózgu. Umyć szybko (< 1 min) w ciemności, odessać supernatant z mózgu i wyrzucić.
- Powtórz pranie z PBS/T w ciemności w temperaturze pokojowej zgodnie z następującym schematem: 2 szybkie (< 1 min) prania, 1 X 5 min, 3 X 20 min i 1 X 1 h prania. Zabezpiecz nakrętki na probówkach do mikrowirówek i umieść probówki na nutatorze między myciami.
- Jeśli pożądane jest barwienie DAPI, zastąp końcowe 1-godzinne płukanie inkubacją 1 X 30 min z 250 ng / ml DAPI rozcieńczonym w PBS / T, a następnie 2 X szybkie i 1 X 20 min mycia.
- Po ostatnim płukaniu usuń większość supernatantu buforu do płukania, uważając, aby nie zakłócić pracy mózgu, i dodaj 30 μl odczynnika zapobiegającego blaknięciu na bazie glicerolu do mózgu. Inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności bez ruchu przez co najmniej 1 godzinę do 24 godzin.
3. Montaż całego mózgu
- Umieść szklane szkiełko mikroskopowe pod mikroskopem preparacyjnym i oznacz je informacjami identyfikującymi.
UWAGA: Alternatywnie, mózgi można zamontować bezpośrednio na szkle nakrywkowym, aby uzyskać dostęp do obu stron mózgu podczas obrazowania. Protokół opisujący tę procedurę montażu został już wcześniej opublikowany45.
- Wyjmij mózgi z każdej probówki mikrowirówki za pomocą końcówki pipety (przygotowanej za pomocą żyletki w celu usunięcia dna ~ 1 cm z końcówki o pojemności 1-200 μl) i przenieś je na środek szkiełka. Przenieś jak najmniej odczynnika zapobiegającego blaknięciu z mózgiem.
- Użyj kleszczy, aby ustawić mózgi w pożądanej orientacji (np. grzbietowo skierowaną w stronę górnej części szkiełka i przednią powierzchnią skierowaną do góry w celu zobrazowania płata czułkowego). Orientując mózgi, weź pod uwagę ścieżkę światła mikroskopu, która ma być użyta do ich obrazowania.
- Usuń nadmiar odczynnika zapobiegającego blaknięciu ze szkiełka za pomocą spiczastego rogu złożonej tkanki laboratoryjnej, nie naruszając mózgu. Pozostaw zjeżdżalnię na ~ 5-10 minut w ciemności, aby mózg mógł przylgnąć do zjeżdżalni.
- Otocz mózgi muchy czterema małymi kawałkami potłuczonego szkła nakrywkowego umieszczonymi po każdej stronie mózgu, aby utworzyć kwadrat o wymiarach ~ 19 mm x 19 mm. Umieść jedną krawędź szkła nakrywkowego nr 1,5 o wymiarach 22 mm x 22 mm tuż przed jednym z tych małych kawałków szkła i delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na mózg, aby zakończyć montaż mostka.
- Powoli dozuj świeży odczynnik zapobiegający blaknięciu, aby wypełnić powierzchnię pod szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie naruszyć szkiełka nakrywkowego ani mózgu. Zetrzyj nadmiar środka zapobiegającego blaknięciu za pomocą spiczastego rogu złożonej chusteczki laboratoryjnej, nie kontaktując się bezpośrednio ze szkiełkiem nakrywkowym.
- Dodaj kroplę przezroczystego, szybkoschnącego lakieru do paznokci w każdym z czterech rogów szkiełka nakrywkowego. Pozostawić do wyschnięcia na ~ 10 min. Następnie uszczelnij cztery krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby całkowicie zakryć mózgi.
- Natychmiast pobrać obraz mózgu lub przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie gotowy.
- Jeśli obrazujesz wewnętrzną fluorescencję z fuzji białek fluorescencyjnych Htt, zobrazuj mózgi w ciągu 24 godzin, aby uzyskać najlepszy sygnał.
4. Obrazowanie i kwantyfikacja prionopodobnej transmisji agregatów
- Zobrazuj zamontowane mózgi za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejowy 40X lub 60/63X, aby zebrać obrazy z-slice przez obszar mózgu, w którym ulegają ekspresji wybrane sterowniki Gal4 i QF (Figura 2A, B).
- Wzbudzić fuzje białek fluorescencyjnych lub białek znakowanych immunologicznie za pomocą odpowiednich laserów (np. 488 nm dla GFP/YFP/FITC lub 552 nm dla mCherry/Cy3). Ustaw okna detekcji, które przechwytują maksymalny sygnał fluorescencyjny, jednocześnie eliminując przesłuchy kanałów, korzystając z systemu detekcji spektralnej lub filtrów emisji pasmowych/długoprzepustowych specyficznych dla każdego fluoroforu.
UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obrazowania agregatów białkowych. Piksele w środku każdego agregatu mogą łatwo ulec nasyceniu, zwłaszcza w przypadku większych agregatów. Staraj się zminimalizować nasycenie obrazu, ale pamiętaj o ryzyku utraty sygnału z mniejszych zagregowanych gatunków (Rysunek 2B, C, D). Zbyt duże nasycenie zwiększy tło obrazu, co utrudni identyfikację izolowanych punktów punktowych. Przetestuj różne ustawienia obrazowania w celu optymalizacji przed wykonaniem ostatecznych obrazów w każdym zestawie danych.
- Analizuj dane, określając ilościowo poszczególne punkty albo ręcznie, przechodząc przez poszczególne wycinki z (np. Rysunek 2C i Rysunek 4A), albo po wyrenderowaniu przekrojów konfokalnych w 3 wymiarach (Rysunek 3A, B).
nuta: Można to zrobić w Image J lub innym oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
- Jeśli agregaty są dobrze oddzielone, a fluorescencja tła jest minimalna, użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby systematycznie identyfikować, określać ilościowo i analizować agregaty jako odrębne "obiekty" lub "powierzchnie" w rekonstrukcji 3D stosu konfokalnego (Rysunek 3B).
nuta: Opisane działania programowe są specyficzne dla użytego tutaj instrumentu i oprogramowania (patrz Spis materiałów).
- Wizualizacja konfokalnej serii Z w trybie wyświetlania 3D. Użyj kreatora "Analiza", aby zidentyfikować poszczególne punkty w wybranym kanale (np. czerwony kanał dla agregatów HttQ91-mCherry na rysunku 3). Dostosuj progi i filtry, aby dokładnie odwzorować wszystkie agregacje o niejednorodnych rozmiarach jako pojedyncze obiekty na obrazie.
- Włącz opcję "Podziel obiekty" w obszarze "Filtr wstępny przetwarzania binarnego", aby oddzielić ściśle powiązane agregacje, które są nieprawidłowo scalane przez algorytm oprogramowania. Zwróć uwagę, że całkowita liczba obiektów i związane z nimi pomiary są podawane w sekcji "Pomiary"
nuta: Ta metoda ilościowego oznaczania zmutowanych agregatów Htt nie jest podatna na protokół barwienia immunologicznego, ponieważ środek agregatów amyloidowych jest nieprzepuszczalny dla przeciwciał. W rezultacie, agregaty pojawiają się pod mikroskopem jako struktury przypominające pierścienie, a oprogramowanie do analizy obrazu nie jest w stanie dokładnie zidentyfikować i rozróżnić tych pojedynczych "plam".
- Określ ilościowo agregacje Htt typu dzikiego, ręcznie przesuwając się przez stos z i oceniając agregaty Htt typu dzikiego, upewniając się, że żadne agregacje nie są podwójnie punktowane, jeśli występują w więcej niż jednym wycinku (Rysunek 4A).
nuta: To ręczne podejście do kwantyfikacji może być stosowane, gdy liczba agregatów w każdym stosie konfokalnym jest rozsądna (np. 20-50). Jest to również pomocne, gdy oprogramowanie do analizy obrazu nie jest w stanie odróżnić poszczególnych punktów od otaczającego sygnału w tym samym kanale (np. sygnał z rozproszonego Htt typu dzikiego w pobliskich komórkach) (Rysunek 2B, C i Rysunek 4A). Kwantyfikacja agregatów Htt typu dzikiego może być również trudna, ponieważ wiele normalnych struktur w mózgu wydaje się punktowych (np. procesy komórkowe i synapsy). Kolokacja sygnałów Htt typu dzikiego i zmutowanego może być wykorzystana jako kryterium wyboru; jednak możliwe jest, że niektóre zmutowane "nasiona" Htt spadną poniżej granicy wykrywalności konfokalu. Białko inne niż Htt, które nie agreguje się w komórkach biorcy (np. GFP), może być używane do oznaczania niepowiązanych struktur punktowych w mózgu.
- Skorzystaj z oprogramowania do analizy obrazu, aby przeprowadzić dalszą charakterystykę poszczególnych agregatów. Na przykład określ rozkład wielkości agregatów (Figura 3C), procentową kolokalizację między zmutowanymi i dzikimi białkami Htt (Figura 4A) lub bezpośrednio zmierz interakcje białko-białko za pomocą FRET (Figura 4B).
- Określ rozkład wielkości poszczególnych punktów za pomocą algorytmu wykrywania punktowego lub powierzchniowego, który dokładnie identyfikuje wszystkie widoczne agregaty w danym kanale. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby wykonać odpowiednie pomiary plam lub powierzchni, na przykład uzyskać informacje o "średnicy kruszywa" (rys. 3C), "objętości" lub "intensywności" z "Pomiarów" w kreatorze "Analiza" oprogramowania opisanym w kroku 4.2.1.
nuta: Na rysunku 3C przedstawiono rozkład średnic dla wszystkich punktów HttQ91-mCherry zidentyfikowanych w pojedynczym kłębuszku DA1.
- Określ procentową kolokalizację między agregatami HttQ25-YFP i HttQ91-mCherry, ręcznie przesuwając plasterek po wycinku przez konfokalny stos z (najdokładniejsza metoda). Należy jednak uważać, aby nie liczyć żadnych agregatów dwa razy. Aby temu zapobiec, należy liczyć agregacje w określonym wycinku z tylko wtedy, gdy płaszczyzna ostrości przechodzi przez środek agregacji (Rysunek 4A).
- Obliczać wydajność FRET dla indukowanych agregatów HttQ25-YFP z kolokalizowanym sygnałem HttQ91-mCherry przy użyciu metody fotowybielania akceptorowego.
- Po pierwsze, wyeliminuj potencjalne przesłuchy między kanałami YFP i mCherry, ustanawiając okna detekcji dla sygnałów tylko mCherry i tylko YFP, które nie wytwarzają sygnału w drugim kanale. Korzystając z tych ustawień, wykonaj zdjęcie "przed" poszczególnych punktów punktowych HttQ25-YFP i powiązanego z nimi sygnału HttQ91-mCherry ( Rysunek 4B).
- Następnie fotowybielaj sygnał mCherry, dostosowując czerwony laser (np. 552 nm) do 100% intensywności i skanuj, aż sygnał zniknie. Powróć do ustawień używanych dla "obrazu przed" i zrób "obraz po" tego samego punktu (Rysunek 4B).
- Oblicz pomiary intensywności fluorescencji dla każdego punktu, przed i po fotowybielaniu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
- Oblicz wydajność FRET, odejmując fluorescencję dawcy YFP mierzoną w "przed" obrazie (YFPinitial) od fluorescencji dawcy YFP w "poobrazie" (YFPfinal). Podziel tę wartość przez YFPfinal i pomnóż przez 100,
nuta: Wydajność FRET można obliczyć piksel po pikselu lub ogólnie dla każdego agregatu HttQ25-YFP (rysunek 4B). Fotowybielanie akceptorowe jest szczególnie przydatną techniką obliczania wydajności FRET, gdy sygnał mCherry związany z każdym punktem HttQ25-YFP jest wystarczająco wysoki, aby wytworzyć wykrywalne wygaszenie YFP po fotowybielaniu mCherry.
