Method Article

Obrazowanie i kwantyfikacja agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Donnelly, K. M., et al. Monitorowanie transmisji między komórkami prionopodobnych agregatów białkowych u Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje obrazowanie i kwantyfikację agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila. Mózgi są naprawiane, myte i traktowane środkiem zapobiegającym blaknięciu przed zamontowaniem. Obrazy są rejestrowane za pomocą mikroskopu konfokalnego i oznaczane ilościowo w celu obserwacji transmisji zmutowanych agregatów białkowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sprzężenie ekspresji transgenu Htt za pośrednictwem Gal4 i QF u Drosophila

  1. Zbieraj i/lub generuj transgeniczne linie Drosophila melanogaster zawierające specyficzne tkankowo "sterowniki" Gal4 lub QF, a także linie zawierające transgeny Htt typu dzikiego lub zmutowanego poniżej Gal4-UAS lub QF-QUAS. Upewnij się, że białka, które ulegają ekspresji z tych transgenów, są połączone z białkami fluorescencyjnymi lub znakowane epitopami, aby umożliwić różnicowanie zmutowanych i dzikich produktów transgenu Htt w tej samej muszce. Patrz rysunek 1.
    UWAGA:     Zazwyczaj używamy fragmentów eksonu 1 ludzkiego genu Htt. Jednak zami....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1. Genetyczne podejście do sprzężonej ekspresji zmutowanych i dzikich transgenów Htt przy użyciu binarnych systemów ekspresji QF-QUAS i Gal4-UAS. W "komórce A" zmutowane białko Htt znakowane mCherry zawierające patogenny odcinek polyQ (Q91) ulega ekspresji za pomocą sterownika QF znajdującego się za tkankowo specyficznym promotorem A ("PA"). W "komórce B" znakowany YFP Htt typu dzikiego zawi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10X, pH 7,4ThermoFisher NaukowyZobacz materiał AM9625Rozcieńczyć do 1X
Tryton X-100Sigma-AldrichT9284-1L
Chusteczki KimwipesThomas NaukowyNumer katalogowy: 2904F24
20% paraformaldehyd (PFA)Nauki o mikroskopii elektronowej15713-S
Normalna surowica kozia (NGS), filtrowanaLaboratoria Biologiczne LampireNumer telefonu 7332500Podwielokrotność i zamrożenie po otrzymaniu
Kurczak anty-GFPAves LabsGFP-1020Stosować w rozcieńczeniu 1:500
Królik anty-DsRedClontech632496Stosować w rozcieńczeniu 1:2000; potrafi rozpoznać białka fluorescencyjne na bazie DsRed (np. mCherry, mStrawberry, tdTomato, itp.)
Mysz anty-BruchpilotBadania rozwojowe Hybridoma BankZobacz materiał NC82Stosować w rozcieńczeniu 1:100; oznaczy aktywne struktury presynaptyczne w mózgu muchy
FITC anty-kurczakThermoFisher NaukowyZobacz materiał SA1-7200Stosować w rozcieńczeniu 1:250
Alexa Fluor 568 anty-królikTechnologie życioweA11011Stosować w rozcieńczeniu 1:250
Przeciwciało przeciw myszom Alexa Fluor 647Technologie życioweNr kat. A21235Stosować w rozcieńczeniu 1:250
Odczynnik przeciw blaknięciu SlowfadeTechnologie życioweS36936
Szkiełka mikroskopowe (25 x 75 x 1,0 mm)Fisher Naukowy12-550-143
Szkło nakrywkowe (22 x 22 mm)Globus NaukowyRozdział 1404-15
Kleszcze klasy Dumont Biology, styl 3Teda PellaOkręg wyborczy 503Użyj w ręce niedominującej
Kleszcze klasy Dumont Biology, styl 5Teda PellaOkręg wyborczy 505Użyj w ręce dominującej
Oprogramowanie do analizy obrazu LAS XKsięga Leica
Oprogramowanie do analizy obrazu ImarisPłaszczyzna bitowa
Gold powiedział: TGL TGL

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AggregatesDrosophila BrainsConfocal MicroscopyImage QuantificationFluorescent TaggingCo localization AnalysisFixative SolutionAntifade ReagentZ stack ImagingMutant Protein

Related Articles