$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie myszy do operacji
- Wyjmij mysz z klatki domowej i zważ (g).
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej izofluranu i ustaw tlen na 2 l/min, a parownik izofluranu na 5, aby wywołać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, około 3-5 min. Monitoruj spowolniony oddech i unieruchomienie. Sprawdź, czy mysz jest w pełni uspokojona za pomocą odruchu szczypania palców u stóp.
- Gdy mysz jest w pełni uspokojona, umieść ją w stereotaktycznej ramce i zabezpiecz nos w stożku nosowym, który jest przymocowany rurką do izofluranu. Włóż nauszniki do kanału słuchowego i dokręć, upewniając się, że głowa jest stabilna.
- Ogol głowę od ucha do ucha i od między oczami do tyłu uszu.
- Wysterylizuj skórę naprzemiennymi chusteczkami z alkoholem izopropylowym i roztworem jodu betadyny, 3 razy każda.
- Nałóż sztuczne łzy na oba oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas zabiegu chirurgicznego.
2. Zabieg chirurgiczny
- Monitoruj głębokość znieczulenia, ściskając palec u nogi lub ogon. Mysz znajduje się w odpowiedniej płaszczyźnie operacyjnej, gdy nie ma odpowiedzi, a oddech jest powolny i równomierny.
- Wykonaj przystrzałkowe nacięcie skóry od tuż za oczami do prawie między uszami jednym, zdecydowanym ruchem za pomocą ostrza skalpela nr 11. Odsuń skórę na bok i przytnij prawą stronę hemostatem.
- Oczyść czaszkę z leżącej nad nią błony za pomocą matowej strony skalpela nr 11 i aplikatorów z bawełnianą końcówką. Opcjonalnie przetrzyj czaszkę aplikatorem z bawełnianą końcówką zamoczonym w 0,9% roztworze soli fizjologicznej. Pozostawić do całkowitego wyschnięcia.
- Za pomocą małej linijki zaznacz przednią granicę kraniotomii na 1 mm ogonowo do szwu koronalnego, a lewą krawędź kraniotomii na 1 mm bocznie do szwu strzałkowego (ryc. 1) za pomocą trwałego markera. Następnie zaznacz prawe i ogonowe granice kraniotomii w odległości 4 mm od szwów strzałkowych i koronalnych odpowiednio (ryc. 1).
- Za pomocą wiertła 0,5 mm rozpocznij wykonywanie kraniotomii, wiercąc powoli zgodnie z konturem markera permanentnego. Pamiętaj, aby nie przebić się całkowicie przez czaszkę. Delikatnie dociśnij izolowany kawałek kości ciemieniowej kleszczami nr 5, obszary osłabienia ustąpią pod naciskiem. Gdy przerzedzona kość jest wystarczająco słaba na całym obwodzie, kawałek kości jest gotowy do usunięcia.
nuta: Jeśli badacz ma trudności z usunięciem kości w jednym kawałku, sugeruje to, że kość nie została wystarczająco rozrzedzona podczas wiercenia. Rozważ dalsze wiercenie czaszki u kolejnych zwierząt, aby ułatwić łatwe usunięcie kawałka kości.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę o sile 23 g nanieść niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej, aby namoczyć izolowaną kość i wywiercony obszar.
- Przymocuj ramię manipulatora do sprzętu stereotaktycznego. Przymocuj nowe ostrze skalpela nr 11 do uchwytu sondy tak, aby ostra strona ostrza była skierowana do przodu.
nuta: Chociaż tkanki rostralne i ogonowe doświadczają odpowiednio ostrych i krawędzi ostrza, uszkodzenia mechaniczne wywołane urazem penetrującym są porównywalne na całym obszarze zmiany. Nie obserwujemy istotnych różnic w głównych cechach glejozy reaktywnej, w tym w regulacji w górę ekspresji lub proliferacji GFAP, między odcinkami rostralnymi i ogonowymi.
- Trzymając ramię manipulatora z dala od drogi, ostrożnie podnieś izolowaną kość za pomocą kleszczy ustawionych pod kątem 5/45. Włóż końcówkę kleszczy z boku izolowanej kości i podnieś, używając dźwigni, aby jednym pełnym ruchem oderwać pozostawiony kawałek kości.
nuta: Uważaj, aby nie dźgnąć mózgu ani nie naruszyć opony twardej pod czaszką.
- Weź mały kawałek nasączonej, wchłanialnej pianki żelowej i umieść go na odkrytym mózgu, aby zapobiec jego wysychaniu i wchłonięciu krwi, która może być obecna.
- Gdy pianka żelowa znajdzie się na miejscu, odchyl ramię manipulatora na miejsce i dostosuj ostrze do środka kraniotomii nad pianką żelową. Usuń piankę żelową i opuść ostrze, aż końcówka dotknie opony twardej bez nakłuwania opony twardej. Zaznacz współrzędne grzbietowe/brzuszne za pomocą skali noniusza na pionowym ramieniu stereotaktycznego.
- Za pomocą ramienia manipulatora powoli opuść ostrze dokładnie 3 mm w głąb mózgu. Osiąga się to za pomocą oznaczeń skali noniusza na ramieniu manipulatora. Pozostaw ostrze na miejscu przez 5-10 sekund. Przesuń ramię stereotaktyczne z mocowaniem ostrza rostral do ogona trzy razy, pozwalając ostrzu dotrzeć do rostralnych i ogonowych granic kraniotomii przed przejściem na przeciwległy koniec.
nuta: Opona twarda nie jest usuwana przed włożeniem ostrza. W przeciwieństwie do opony twardej szczura, która ma grubość ~80 μm7, opona twarda myszy jest znacznie cieńsza (ma tylko kilka warstw komórek) i nie wytwarza znaczącego oporu na ostrze skalpela podczas wkładania. Użyj nowego ostrza skalpela dla każdej myszy, aby upewnić się, że każde zwierzę otrzymuje stałe obrażenia.
- Powoli podnieś ramię stereotaktyczne, wyjmując ostrze z mózgu. Po wyjęciu ostrza natychmiast umieść kolejny kawałek pianki żelowej na powierzchni mózgu, aby wchłonąć nadmiar krwi lub płynu.
- W międzyczasie zdejmij ramię stereotaktyczne i wyrzuć ostrze skalpela nr 11. Po ustaniu krwawienia usuń piankę żelową.
- Zamknij ranę, zszywając skórę niewchłanialnymi szwami, takimi jak etylon lub prolen. Szwy należy usunąć 9-10 dni po zabiegu.
- Umieść mysz z powrotem w klatce domowej i pozwól myszy powoli dojść do siebie na poduszce grzewczej i monitoruj, czy nie ma oznak niepokoju. Rekonwalescencja po znieczuleniu wywołanym izofluoranem następuje zwykle w ciągu 2-5 minut po usunięciu z izofluoranu. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska pozycji mostka.
- Podawać podskórnie 0,5-1 ml roztworu Ringera z mleczanami, aby zapewnić nawilżenie.
