Ocena kolonizacji bakteryjnej w mózgu myszy po zakażeniu Listeria monocytogenes

Streszczenie

Źródło: Ghosh, P., et al., Listeria monocytogenes Infection of the Brain. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego z perfundowanego mózgu myszy zakażonego Listeria monocytogenes.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Grabież organów i określanie obciążenia bakteryjnego

1. Po perfuzji należy pobrać narządy (np. wątrobę, śledzionę), ostrożnie usuwając wszelkie przyczepione naczynia krwionośne i więzadła i umieszczając narządy oddzielnie w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml sterylnego zimnego (4 °C) PBS. Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu dalszego przetwarzania.
2. Aby pobrać mózg, odetnij głowę za uszami za pomocą nożyczek i przetnij skórę głowy między oczami zwierzęcia wzdłuż linii środkowej. W razie potrzeby odetnij nadmiar tkanki, trzymając nożyczki przyciśnięte do czaszki.
   1. Delikatnie włóż jedną końcówkę nożyczek do otworu wielkiego (otworu w podstawie czaszki, przez który przechodzi rdzeń kręgowy) i naciąć bocznie w czaszce po obu stronach.
   2. Delikatnie przeciąć czaszkę między oczami gryzonia wzdłuż linii środkowej, wywierając nacisk boczny. Unikaj zaburzeń mózgu i utrzymuj minimalny kontakt między tkanką mózgową a nożyczkami.
   3. Za pomocą kleszczy z cienką końcówką otwórz czaszkę, aby odsłonić mózg i umieść szpatułkę między spodem mózgu a podstawą czaszki, aby usunąć mózg.
      nuta: Powoduje to rozerwanie włókien nerwowych mózgu.
   4. Ostrożnie przenieś mózg do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml sterylnego zimnego PBS.
   5. Wyrzuć tuszę myszy i powtórz te czynności dla pozostałych zwierząt.
      nuta: Po pobraniu wszystkich narządów należy oczyścić obszar zabiegowy i przygotować się do homogenizacji narządów w celu określenia obciążenia bakteryjnego.
3. Wyczyść i wysterylizuj końcówkę homogenizatora tkankowego umieszczonego w komorze bezpieczeństwa biologicznego, wkładając końcówkę i uruchamiając homogenizator przez 10 sekund sekwencyjnie w 5% wybielaczu, sterylnej wodzie, 75% etanolu i sterylnej wodzie, z których każdy znajduje się w oddzielnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
4. Homogenizuj zainfekowany mózg (~20 s przy ustawieniu 6, maksymalna prędkość obrotowa) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, aż nie pozostaną żadne widoczne fragmenty tkanki.
   1. Wyczyść homogenizator zgodnie z opisem w kroku 1.3, aby zapobiec przeniesieniu zanieczyszczenia bakteryjnego na następną próbkę narządu.
   2. Przeprowadź proces homogenizacji dla wszystkich innych narządów (np. wątroby, śledziony).
   3. Po zakończeniu procesu homogenizacji wyczyść homogenizator zgodnie z opisem w kroku 1.3 i przechowuj go do dalszego użycia.
5. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia homogenatów narządów w sterylnym PBS i umieścić rozcieńczenia na płytkach BHI agar/streptomycyna w celu oznaczenia CFU na narząd.
   UWAGA: Podobną metodę stosuje się w celu oznaczenia jtk na ml krwi.
   1. Po nasianiu wszystkich rozcieńczeń należy przenieść płytki na noc do inkubatora o temperaturze 37 °C.
   2. Następnego dnia policz liczbę kolonii na każdej szalce, aby określić całkowitą liczbę bakterii w narządzie lub ml krwi w następujący sposób:
      CFU/organ = (liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia) / ml homogenatu posianego x 5
      CFU/ml krwi = (liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia) / ml krwi posianej

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywki do infuzji mózgu i serca	Becton Dickinson	Numer katalogowy: 237200
Siarczan streptomycyny	Amresco (angielski)	Numer katalogowy: 0382-50G
Szalki Petriego	Firma VWR	25384-342
glicerol	Firma VWR	Numer katalogowy: 97062-832
Homogenizator podstawowy IKA T18 ULTRA-TURRAX	Międzynarodowa	3352109	Modelu: T18BS1
Spektrofotometr	Beckman Coulter	Seria DU 800
Myszy BALB/c	Laboratorium Jacksona	Wzór #000651
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 60004
Probówki stożkowe 15 ml	Firma VWR	21008-918
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Corning	46-013-CM
Szpatułka ze stali nierdzewnej	Firma VWR	82027-520
Nożyczki ze stali nierdzewnej (4,5 cala)	Firma VWR	82027-578
Kleszczyki z cienką końcówką ze stali nierdzewnej (6 cali)	Firma VWR	Numer katalogowy: 82027-406

powiedział: analiza ryzyka (IKA)