$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Protokół immunofluorescencji
- Sekcja tkanek
- Danio pręgowanego należy złożyć w ofierze przez zanurzenie w lodowatej wodzie (5 części lodu / 1 część wody, 4 °C); pozostawić je do momentu ustania wszelkich ruchów, aby zapewnić śmierć przez niedotlenienie.
- Zdejmij głowę żyletką. Usuń tkankę miękką z brzusznej strony czaszki za pomocą kleszczy. Otwórz czaszkę i usuń kość z brzusznej strony mózgu. Usuń skórę i kości czaszki z grzbietowej strony mózgu. Usuń mózg.
- Utrwalanie tkanek
- Utrwalić mózg przez zanurzenie na 3 godziny w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C.
- Przygotować 0,1 M bufor fosforanowy (PB) rozpuszczając 1,755 gNaH2PO,4H2O i 4,575 gNa2HPO4 w 450 ml wody destylowanej (dH2O) i dostosować do pH 7,4 z niezbędną ilością NaOH 1N.
- Przygotować 4% PFA, rozpuszczając 4 g PFA w 100 ml 0,1 M PB (pH 7,4) przez mieszanie na płycie grzewczej. Po osiągnięciu temperatury 60 °C dodać 2-4 krople NaOH 1N do uzyskania klarownego roztworu. Pozostaw PFA 4% w temperaturze pokojowej (RT) i kontroluj pH. Dostosuj pH do 7.4.
nuta: Czas utrwalenia zależy od wielkości tkanki. Utrwalanie tkanek dłużej niż 4–6 godzin może prowadzić do nadmiernej fiksacji, która maskuje antygeny i ogranicza wiązanie przeciwciało-epitop.
- Osadzanie tkanek
- Płukać chusteczki 3x po 5 minut w 0,1 M PB (pH 7,4).
- W celu krioprotekcji należy przenieść tkanki do 20% sacharozy w PB (0,1 M, pH 7,4) i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie przenieść tkanki do 30% sacharozy w 0,1 M PB (pH 7,4) i przechowywać przez dodatkową noc w temperaturze 4 °C.
- Osadź tkanki w bloku związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Aby to zrobić, przygotuj mały dewar ciekłego azotu, weź folię aluminiową i przekrój ją na pół, aby utworzyć patelnię. Miskę zawierającą tkanki wypełnione związkiem OCT należy zanurzyć w ciekłym azocie do czasu schłodzenia związku OCT. Zamrożone tkanki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu pokrojenia.
- Cięcie tkanek
- Przenieść zamrożone bloki tkanek do kriostatu w temperaturze -20 °C i przeciąć na odcinki czołowe lub strzałkowe o wielkości 10 μm.
- Zebrać tkanki w naprzemiennych odcinkach szeregowych na samoprzylepnych szkiełkach podstawowych odpowiednich do celów immunohistochemicznych i przechowywać je w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
nuta: Przechowuj preparaty w temperaturze od -20 °C do 4 °C w ciemnym pudełku na slajdy lub skoroszycie slajdów.
- Blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania i przepuszczalność tkanek
- Odznaczyć obszar tkanki na szkiełku za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki.
- Przepłukać sekcje 3x po 5 minut każda, 0,1 M PB (pH 7,4).
- Inkubować skrawki z 1% normalną surowicą osła rozpuszczoną w buforze permeabilizacyjnym PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu przeniknięcia przez błonę komórkową i zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania.
- Przygotować Triton X-100 0,3%, rozpuszczając 0,3 ml Triton X-100 w 100 ml 0,1 M PB (pH 7,4).
- Przygotować roztwór blokujący, rozpuszczając 1% normalnej surowicy osła w PB zawierającej 0,3% TritonX-100.
nuta: Gatunki zwierzęce surowicy stosowanej w permeabilizacji i blokowania są zależne od gospodarza przeciwciała drugorzędowego.
- Inkubacja z mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych
- Przepłukać sekcje 3x po 5 minut każda, 0,1 M PB (pH 7,4).
- Inkubować skrawki przez noc w wilgotnym pudełku w temperaturze pokojowej z mieszaniną pierwszorzędowych przeciwciał rozcieńczonych w PB-T. Można stosować następujące mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych: przeciwciało kozie przeciwko receptorowi oreksyny (OX-2R) rozcieńczone 1:100 / przeciwciało królika przeciwko receptorowi kannabinoidowemu (CB1R) rozcieńczone 1:100 lub przeciwciało kozie przeciwko peptydowi oreksyny (OX-A) rozcieńczone 1:100 / przeciwciało królicze przeciwko CB1R rozcieńczone 1:100.
- Inkubacja z mieszaniną przeciwciał drugorzędowych
- Przepłukać sekcje 3x po 5 minut każda, 0,1 M PB (pH 7,4).
- Inkubować skrawki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z 1) mieszanką przeciwciała drugorzędowego skoniugowanego przeciwko królikowi Alexa Fluor 488 i przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z kozłem przeciwko ośle Alexa Fluor 594, rozcieńczonego w stosunku 1:100 w PB-T; lub 2) mieszanina przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z kozłem Alexa Fluor 488 i przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z kozłem przeciwko oślikowi Alexa Fluor 594 rozcieńczonego w stosunku 1:100 w PB-T.
nuta: Należy stosować przeciwciała drugorzędowe wytworzone u tego samego gospodarza zwierzęcego. Surowica prawidłowa musi należeć do tego samego gatunku przeciwciał drugorzędowych (np. należy stosować przeciwciała drugorzędowe wytworzone u osła i normalną surowicę osła). Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe buforem blokującym zawierającym detergent, aby zwiększyć przepuszczalność komórek i zmniejszyć tło.
- Montaż tkanek
- Przepłukać sekcje 3x po 5 minut każda, 0,1 M PB (pH 7,4).
- Wybarwić skrawki barwnikiem jądrowym DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol) przygotowanym rozpuszczeniem 1,5 μl DAPI (1 mg/ml) w 3 ml PB.
- Szkiełka nakrywkowe z medium montażowym (patrz Tabela materiałów). To wodne podłoże montażowe stabilizuje próbkę tkanki i plami do długotrwałego użytkowania. Próbki fluorescencyjne mogą być przechowywane w ciemności w temperaturze 4 °C. Aby przedłużyć żywotność fluoroforów, użyj środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.
nuta: Wybierz dobry nośnik montażowy. Jednym z najważniejszych parametrów środków montażowych jest współczynnik załamania światła (nD), który powinien wynosić około 1,5, czyli współczynnik załamania światła szkła. Zastosowana tutaj pożywka montażowa może być stosowana szczególnie w przypadku próbki przygotowanej do oznaczania enzymów i lipidów (tj. próbki, która nie może być odwodniona wstępującą serią alkoholu).
- Formantów
- Powtórzyć sekcje 1.1–1.8, pomijając przeciwciało pierwszorzędowe lub drugorzędowe lub podstawiając w określonym kroku pierwszorzędowe lub drugorzędowe surowice odpornościowe PB (kontrola ujemna).
- Powtórzyć sekcje 1.1–1.8, wstępnie wchłaniając każde przeciwciało pierwszorzędowe z nadmiarem względnego peptydu (100 mg peptydu/1 ml rozcieńczonej surowicy odpornościowej).
- Powtórzyć sekcje 1.1–1.8 na wycinkach mózgu myszy (kontrola pozytywna).
nuta: Przygotuj wszystkie na świeżo, na krótko przed rozpoczęciem. Na każdym etapie ostrożnie usuwaj nadmiar płynu za pomocą pipety lub bibuły filtracyjnej wokół sekcji, zawsze utrzymując sekcję wilgotną.