1. Ustanawianie modelu BBB
Uwaga: Do ustalenia modelu bariery krew-mózg (BBB) sugerujemy użycie dostępnych na rynku pierwotnych komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu szczura (RBMEC) i astrocytów korowych szczurów (RCA). Wszystkie czynności muszą być wykonywane przy użyciu sterylnych odczynników i materiałów jednorazowego użytku przechowywanych w okapie z przepływem laminarnym.
- Hodowla komórkowa
- Kolby do hodowli komórkowych pokryć poli-L-lizyną 100 μg/ml (1 godz. w temperaturze pokojowej, RT) lub fibronektyną 50 μg/ml (1 godz. w temperaturze 37 °C) w celu ułatwienia przyłączenia odpowiednio RCA lub RBMEC. Następnie rozmrozić 1 x 106 RCA i 5 x 105 RBMEC w pożywce komórek śródbłonka, uzupełnionych 5% płodową surowicą bydlęcą, 1% suplementem wzrostu komórek śródbłonka i 1% penicyliną/streptomycyną (sECM). Wysiewanie RCA w kolbie T175 w 20 ml sECM i RBMEC w kolbie T75 w 10 ml sECM.
Uwaga: Pasaże rozmrażania i wysiewu RCA i RBMEC muszą być dostosowane pod względem gęstości komórek i czasu w hodowli zgodnie z liczbą warunków doświadczalnych, które mają być badane za pomocą modelu BBB. Zaczynając od 1 fiolki po 1 x 106 RCA i 1 fiolki po 5 x 105 RBMEC, możliwe jest uzyskanie do 20 wkładek łożyskowych BBB.
- Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze przez około 6 dni, aż do około 80% konfluencji dla RCA i ponad 90% konfluencji dla RBMEC. Odłączyć komórki za pomocą roztworu kwasu trypsyna-etylenodiamina tetraoctowa (trypsyna-EDTA) (trypsyna 1:250) na 5 minut (1 ml trypsyny dla kolb T75 i 2 ml dla kolb T175). Zatrzymać aktywność trypsyny za pomocą sECM (2:1), odwirować zawiesiny komórek w stężeniu 750 × g przez 5 minut i ponownie zawiesić granulki w 60 ml sECM.
- Podzielić RBMEC na 3 kolby T175 i hodować w sECM przez kolejne 3 dni przed wysiewem na płytki. Policz całkowitą liczbę żywych RCA, obserwując zawiesinę komórek rozcieńczoną w stosunku 1:1 błękitem trypanowym pod mikroskopem optycznym w komorze Burkera.
- Wysiew komórek na wkładki
- Z jednej strony membrany politereftalanu etylenu (PET) 6 przezroczystych wkładek wielodołkowych należy potraktować poli-L-lizyną 100 μg/ml, a z drugiej strony fibronektyną 50 μg/ml, aby umożliwić przyłączenie RCA i BMEC. Z wkładkami należy obchodzić się pęsetą, aby uniknąć kontaktu z membraną PET.
- Umieścić wkładki w płytce 6-dołkowej i dodać roztwór fibronektyny (minimum 500 μl) do górnej komory. Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze 37 °C należy usunąć roztwór fibronektyny, zdjąć płytki wielodołkowe i położyć je do góry nogami na dnie płytki Petriegoo długości 150 cm 2, która jest tutaj używana jako sterylne podłoże dla już pokrytych wkładek.
- Delikatnie dodaj 800 μl poli-L-lizyny na spodzie wkładki (jak pokazano na rysunku 1A; określane jako wysiewanie RCA) i trzymaj roztwór na wkładkach przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Odessać roztwór i pozostawić wkładki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut. Wkładki są teraz gotowe do wysiewu komórek, ale mogą być również przechowywane w płytce wielodołkowej przez kilka dni w temperaturze 4 °C przed przystąpieniem do budowy BBB.
Uwaga: Należy pamiętać, aby co najmniej 3 powlekane wkładki były wolne od komórek, które mogą być używane jako kontrole w celu walidacji ustalenia BBB za pomocą pomiarów strumienia FD40.
- Wysiewaj RCA (35 000/cm2) na spodniej stronie wkładek pokrytych poli-L-lizyną, upuszczając 800 μl zawiesiny komórek na odwróconą wkładkę (rysunek 1A). Pozostaw zawiesinę RCA na wkładkach na 4 godziny w temperaturze pokojowej, aby umożliwić skuteczne przymocowanie komórek do membrany.
- Odessać pozostały roztwór, umieścić wkładki w studzienkach zawierających 2 ml sECM i utrzymywać płytkę wielodołkową w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze, zmieniając sECM co 2 dni.
- Po 3 dniach, gdy RCA pokryją dolną powierzchnię wkładki, wysiewaj RBMEC na górną stronę wkładki, wykonując następujące czynności:
- Odłączyć RBMEC od kolb T175 i policzyć całkowitą liczbę żywych komórek, jak podano w krokach 1.1.2 i 1.1.3.
- Umieść RBMEC (60 000 / cm2) na górnej powierzchni wkładki w sECM (1 000 μl) (Rysunek 1B), pozostawiając 3 wkładki tylko z astrocytami, które mają być użyte jako tło transśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER). Umieścić płytkę wielodołkową w standardowych warunkach hodowli. Utrzymuj system do hodowli przez co najmniej 3 dni, zmieniając sECM w komorze wewnętrznej i dolnej co 2 dni.
2. Walidacja BBB
- Pomiar TEER
- W 3 dniu kohodowli należy sprawdzić TEER, wkładając wkładki z łożyskiem BBB do odpowiedniej komory (z nasadką i w której zarówno komora, jak i nasadka zawierają parę elektrod wykrywających napięcie i prąd), wypełnionej 4 ml sECM. Podłączyć do woltomierza / omomierza tkanki nabłonkowej.
- Wraz z pomiarami TEER systemów BBB ogniw zapisz wartości TEER 3 wkładek zawierających RCA, które zostaną odjęte od wartości uzyskanych za pomocą BBB. Pomnóż otrzymane wartości TEER przez powierzchnię wkładki (4,2 cm2), aby wyrazić wyniki jako Ω x cm2.
- Od 3 dnia kohodowli należy codziennie mierzyć wskaźnik TEER. nuta: Po początkowym okresie, w którym TEER wzrasta, zarejestrowane wartości powinny pozostać stabilne przez co najmniej dwa kolejne dni (zwykle między 5. a 7. dniem kohodowli). W tym momencie BBB jest gotowy do drugiego etapu walidacji (sekcja 2.2) i/lub do eksperymentów trans-BBB.
Uwaga: Procedura opisana w ppkt 2.1 może być przeprowadzona na tych samych systemach BBB, które są przeznaczone do następujących doświadczeń przepuszczalności (sekcja 3). Pracuj w sterylnych warunkach.
3. Trans-BBB przenikanie ferrytyn obciążonych FITC (FnN)
Uwaga: Rekombinowany wariant ludzkiej ferrytyny (Fn), wytwarzany przez Escherichia coli i montowany w nanoklatkach (FnN). FnN są ładowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), a stężenia zarówno Fn, jak i załadowanych cząsteczek są dokładnie określane.
- Strumień Trans-BBB FITC i FITC-FnN
- Zmierzyć strumień FITC-FnN od górnej do dolnej komory zwalidowanych modeli BBB (zwykle w 5-7 dniu kohodowli), w porównaniu z strumieniem wolnego barwnika po 7 i 24 godzinach inkubacji, zgodnie z następującymi krokami:
- Dodać FITC-FnN (50 μg/ml FnN, 1,1 μM FITC) lub taką samą ilość wolnego FITC do górnej komory co najmniej 6 systemów BBB dla każdej postaci użytkowej, w celu pobrania 2 ml roztworu sECM z dolnej komory co najmniej 3 wkładek po 7 godzinach, a z dolnej komory pozostałych 3 wkładek po 24 godzinach.
- Zmierzyć intensywność fluorescencji 500 μl pobranych próbek za pomocą spektrofluorometru (λex 488 nm, λem 515 nm, szczelina 5).
- Uzyskać fluorescencję tła sECM, mierząc 500 μl pożywki przy użyciu tych samych parametrów analitycznych. Odejmij fluorescencję tła sECM od wszystkich wartości fluorescencji FITC lub FITC-FnN.
- Oznaczyć stężenie przesiąkniętego FITC lub FITC-FnN, porównując uzyskane wartości fluorescencji z dwiema różnymi krzywymi kalibracyjnymi otrzymanymi przy znanych stężeniach (tj. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) wolnego lub nanoformulacji barwnika rozpuszczonego w 500 μl sECM.
