Pomiar aktywności proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach mózgu szczura

1. Test aktywności proteasomu

UWAGA: Aktywność proteasomu może być mierzona w homogenizowanej tkance mózgowej za pomocą nieco zmodyfikowanej wersji zestawu do aktywności proteasomu 20S. Ten test nie mierzy bezpośrednio aktywności kompletnych kompleksów proteasomu 26S. Mierzy raczej aktywność rdzenia 20S, co oznacza, że może służyć jedynie jako wskaźnik zastępczy do zrozumienia aktywności samego rdzenia, w przeciwieństwie do całego kompleksu proteasomu 26S. Powodzenie tego testu zmniejsza się wraz z powtarzającymi się cyklami zamrażania i rozmrażania i/lub wzrostem poziomu detergentów, zwłaszcza jonowych, i wymaga użycia czytnika płytek z zestawem filtrów 360/460 (wzbudzenie/emisja) i możliwością podgrzewania do 37 °C.

1. Ustawienia czytnika płytek: Wstępnie podgrzać do 37 °C i utrzymać przez cały przebieg.​
   1. Ustaw wzbudzenie na 360 i emisję na 460. Jeśli używana płytka 96-dołkowa jest przezroczysta, ustaw pozycję optyki na dole. Jeśli używana jest ciemna/płytka 96-dołkowa, ustaw pozycję optyki na Góra.
   2. Ustaw starsze modele czytników płytek na Auto-Gain w opcjach odczytu fluorescencyjnego; nowsze modele są do tego przystosowane. Zaprogramuj bieg kinetyczny o czasie 2 h, skanowanie (odczyt) co 30 minut.
2. Rozpuść 10-krotny bufor testowy dostarczony w zestawie w 13,5 ml ultraczystej wody. Dodaj 14 μl 100 mM ATP do teraz 1x bufora; To znacznie zwiększa aktywność proteasomu w próbkach i poprawia wiarygodność testu. Końcowy bufor do testów 20S może być przechowywany na lodzie lub w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania potrzebnego i jest stabilny przez kilka miesięcy.
3. Rozpuść wzorzec AMC dostarczony w zestawie ze 100 μl DMSO. Wykonaj tę czynność w ciemności lub przy słabym oświetleniu, ponieważ norma jest wrażliwa na światło.
4. Utwórz standardową krzywą AMC przy użyciu odtworzonego wzorca, w ciemności lub w warunkach słabego oświetlenia.
   1. W oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml dodać 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 i 0 μl wzorca AMC, co odpowiada stężeniu AMC 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 i 0 μM.
   2. Do tych probówek, w tej samej kolejności, dodaj 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 i 100 μl buforu do oznaczania 20S. W ten sposób powstaje seria wysokich i niskich stężeń AMC, które zostaną wykorzystane do kalibracji czytnika płytek i analizy aktywności proteasomu w homogenizowanych próbkach.
   3. Przechowywać wszystkie rozcieńczone wzorce na lodzie w ciemności, aż będą potrzebne.
5. Rozpuść substrat proteasomu (Suc-LLVY-AMC) dostarczony w zestawie z 65 μl DMSO. Wykonaj ten krok w ciemności lub w warunkach słabego oświetlenia, ponieważ podłoże jest wrażliwe na światło. Utworzyć rozcieńczenie substratu proteasomu w stosunku 1:20 w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przy użyciu buforu testowego 20S. Rozcieńczone podłoże należy przechowywać na lodzie w ciemności, aż będzie potrzebne.
   nuta: Na przykład, jeśli płytka będzie zawierała 10 próbek i 1 ślepą próbę, będziesz potrzebować wystarczającej ilości rozcieńczonego podłoża na 22 dołki (z duplikatami) w ilości 10 μl na studzienkę. Odpowiada to zapotrzebowaniu 220 μl + 30 μl na błędy pipetowania, co wymaga 12,5 μl substratu i 237,5 μl buforu do testu 20S.
6. Rozmrozić żądane próbki (jeśli są zamrożone) i dodać znormalizowaną ilość do płytki 96-dołkowej. Uruchom każdą próbkę w dwóch egzemplarzach. Ilość potrzebnej próbki różni się w zależności od przygotowania tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, 10-20 μg jest wystarczające dla każdej frakcji subkomórkowej.
7. Doprowadzić objętość studzienki próbki do 80 μl wodą ultraczystą. Dodana ilość zależy od objętości dodanej próbki. Na przykład, jeśli próbka 1 zawierała 4,5 μl białka, a próbka 2 8,7 μl, to ilość potrzebnej wody wyniesie odpowiednio 75,5 μl i 71,3 μl. W dwóch oddzielnych studzienkach dodaj 80 μl samej wody; będą to ślepe próby testowe.
   nuta: W celu ograniczenia zmian objętości białka spowodowanych błędami pipetowania, stężenia białek można znormalizować do próbki o najmniejszym stężeniu. Pozwoli to na wykorzystanie tej samej objętości próbki w każdych warunkach.
8. Dodać 10 μl buforu do testu 20S do każdego dołka, w tym ślepych prób testowych. W tym przypadku zalecana jest pipeta powtarzalna/automatyczna, aby zapewnić stałą objętość testu we wszystkich studzienkach.
9. Fakultatywnie: Na tym etapie należy wprowadzić manipulacje in vitro, jeśli jest to pożądane; będzie to wymagało, aby każda próbka miała dodatkowe 2 studzienki na zabieg, łącznie z nośnikiem. Jeśli tak, dodaj 5-10 μl leku/związku będącego przedmiotem zainteresowania do 2 dołków na próbkę i równoważną objętość kontroli/nośnika do kolejnych 2 studzienek. Umieścić płytkę na wstępnie podgrzanym czytniku płytek lub w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut.
10. Wyłącz światła lub wejdź do ciemnego pokoju. Dodać wszystkie 100 μl rozcieńczonych wzorców AMC do nowego dołka; Każdy standard będzie miał pojedynczą studnię.
11. W ciemności dodać 10 μl rozcieńczonego substratu proteasomu do studzienek zawierających próbkę i ślepe próby testowe, ale nie do wzorca AMC. W tym przypadku zalecana jest pipeta powtarzalna/automatyczna, aby zapewnić stałą objętość testu we wszystkich studzienkach.
12. Umieścić płytkę w czytniku płytek i rozpocząć bieg kinetyczny.
    nuta: Płyta nie musi być pod ciągłym mieszaniem podczas biegu kinetycznego, jednak użytkownik może to wybrać, jeśli sobie tego życzy
13. Po zakończeniu cyklu kinetycznego wyeksportuj surowe wartości fluorescencji 360/460 do programu Microsoft Excel.
    1. Uśrednij razem zduplikowane studzienki dla każdego wzorca, każdej próbki i ślepej próby testu dla wszystkich 5 skanów. Wartości surowej fluorescencji powinny wzrastać podczas skanowania próbek, ale pozostać stabilne (lub nieznacznie spaść) w przypadku wzorców i ślepych prób testowych.
    2. Weź najwyższą średnią z odwiertu AMC i podziel przez znane stężenie (20 μM). Podziel tę wartość przez stężenie próbki użytej w teście, aby uzyskać znormalizowaną wartość AMC. Dla każdej próbki i średniej próby ślepej podziel przez znormalizowaną wartość AMC.
    3. Weź tę wartość końcową i podziel ją przez stężenie próbki użytej w teście, aby uzyskać znormalizowaną wartość dla każdej próbki i ślepej próby testu. Zrób to dla wszystkich 5 skanów.
    4. Odejmij znormalizowaną wartość ślepej próby testu od każdej znormalizowanej wartości próbki dla wszystkich 5 skanów.