Artykuł metodologiczny

Uzyskiwanie zawiesin komórkowych z niedokrwionych tkanek mózgowych myszy

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Pösel, C., et al. Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje procedurę izolowania komórek mózgowych i infiltrowanych komórek odpornościowych z niedokrwionych tkanek mózgowych myszy poprzez trawienie enzymatyczne, a następnie usuwanie resztek komórek i mieliny przez wirowanie w gradiacji gęstości, w celu zbadania reakcji na stan zapalny w badaniach nad udarem.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiedni przegląd etyczny zwierząt.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Bufor wytrawiający (1 ml na półkulę): Rozpuść standaryzowaną mieszaninę oczyszczonych enzymów trawiennych, np. Liberazy o niskim stężeniu termolizyny (TL) do stężenia 2U/ml w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) zawierającym wapń (Ca) i magnez (Mg).
  2. Bufor płuczący z DNAzą: Rozpuścić DNAzę I do stężenia 666U/ml w HBSS (bez Ca/Mg (wapń/magnez)) zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS).
  3. Bufor płuczący bez DNAzy: HBSS (bez Ca/Mg) zawierający 10% FCS.
  4. Pożywka o gradiencie gęstości (5 ml na półkulę): przygotować podstawową pożywkę o gradientzie gęstości izotonicznej (SIP; 100%) przez zmieszanie dziewięciu części pożywki o gradionym nasyceniu gęstości z jedną częścią 1,5 M chlorku sodu. Rozcieńczyć SIP do 25% gęstości, dodając odpowiednią objętość HBSS (bez Ca/Mg) zawierającą 3% FCS.

2. Dysocjacja tkanki mózgowej na zawiesiny pojedynczych komórek

  1. Ostrożnie usuń pień mózgu i móżdżek czystą żyletką. Użyj czystej żyletki, aby przeprowadzić półsekcję mózgu i przeciąć każdą półkulę wzdłuż płaszczyzny koronalnej na trzy części o mniej więcej równej wielkości.
  2. Zmielić wyciętą tkankę każdej półkuli przez sitko do komórek o wielkości 100 μm za pomocą końcówki tłoka strzykawki o pojemności 5 ml. Sitko do komórek należy w sposób ciągły płukać lodowatym HBSS (+Ca/Mg). Homogenizowane próbki należy przechowywać na lodzie.
  3. Wirować w temperaturze 286 x g i temperaturze 4°C przez 5 minut, ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml buforu do wytrawiania i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 2 ml. Inkubować zawiesinę przy powolnych, ciągłych obrotach w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Przesiać zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 70 μm i dokładnie spłukać 3 ml buforu płuczącego zawierającego DNAzę, a następnie 15 ml buforu płuczącego niezawierającego DNAzy. Wirować w temperaturze 286 x g i temperaturze 18 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. nuta: Zastosowanie DNAzy eliminuje śluz DNA spowodowany lizą komórek, co może prowadzić do agregacji komórek, zagrażając przeżyciu komórek.

3. Wirowanie w gradiencie gęstości w celu usunięcia mieliny i resztek komórek

  1. Zawiesić osad komórek w 5 ml pożywki o gradiencie gęstości 25% i odpipetować zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml. Dokładnie wymieszać przez wielokrotne i delikatne pipetowanie, unikając tworzenia się pęcherzyków. nuta: W temperaturze pokojowej należy stosować podłoże o gradiencie gęstości, aby zapobiec zbrylaniu się komórek.
  2. Wirować przy 521 x g i temperaturze 18 °C przez 20 minut. Użyć najniższego profilu przyspieszenia wirnika i pozwolić, aby wirnik zatrzymał się bez hamulca. Delikatnie wyjmij probówki z wirówki, nie potrząsając. Ostrożnie odessać płaszcz mielinowy i supernatant, zachowując osad komórkowy na dnie probówki. nuta: Upewnij się, że usunąłeś cały płaszcz mielinowy, ponieważ wszelkie pozostałości zaburzą analizę cytometrii przepływowej.
  3. Zawiesić osad w 10 ml buforu płuczącego niezawierającego DNA i odpipetować zawiesinę do nowej probówki o pojemności 15 ml. nuta: Ten etap mycia ma kluczowe znaczenie, ponieważ wystarczające usunięcie podłoża o gradiencie gęstości znacząco wpływa na ilość i jakość końcowej próbki komórki.
  4. Ponownie odwirować w temperaturze 286 x g i temperaturze 10 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić komórki w 100 μl buforu do płukania na zimno i określić liczbę komórek i żywotność przez wykluczenie błękitu trypanowego w hemocytometrze. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i szybko je przetwarzać.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rotator rurowy MACSmixMiltenyi Biotec GmbH
Wieloślad Heraeusa 3SR+Thermo Scientific
Bufor soli Hanka (HBSS)Gibco/Life Technologies GmbHNr kat. 14175-129
HBSS z wapniem/magnezemGibco/Life Technologies GmbH24020-091
Liberase TLRoche Diagnostics GmbH5401020001Stosować w temperaturze pokojowej
Percoll PlusGE Healthcare Europe GmbH17-5445-01
Surowica bydlęca płoduPAN Biotechnologiczny3302-P101003
Trypan niebieskiGibco/Life Technologies GmbHNumer katalogowy: 15250-061
Trucount (liczba trupów)BD Nauki biologiczne340334
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiBiochrom AGL 182-10
DNaza IRoche Diagnostics GmbH11284932001
Rurka silikonowa, 1mŚwiatowe instrumenty precyzyjne503022
Nożyczki do cienkiej tęczówki ostre/Narzędzia naukoweNumer katalogowy 14028-10
Kleszcze proste 1x2 zębyNarzędzia naukoweNumer katalogowy 11021-14
Kleszcze z końcemNarzędzia naukoweNumer katalogowy 11008-13
Tłok strzykawki o pojemności 5 mlCarl Roth GmbH (Braun)Zobacz materiał EP96.1
Sitko do komórek, 100μmDr I. Schubert, doktor nauk medycznych2360-00
Omnican Fine strzykawka dozująca 1MLBraunTbd
Sitko komórkowe, 70μmGreiner Bio-One GmbH542 070
pipety serologiczne, 10mlGreiner Bio-One GmbHNumer katalogowy: 607180
pipety serologiczne, 10mlSarstedt AG&Co86,12,54,025
pipety serologiczne, 25mlGreiner Bio-One GmbHNumer katalogowy: 760180
Pipety serologiczne, 5mlGreiner Bio-One GmbHNumer katalogowy: 606180
Pipety serologiczne, 25mlSarstedt AG&Co86,16,85,020
Pipety serologiczne, 5 mlSarstedt AG&Co86,12,53,025
Końcówki, 0,1-10μlCorning B.V.Life SciencesNumer katalogowy: 4840
Końcówki, 100-1000μlGreiner Bio-One GmbHNumer katalogowy: 740290
Końcówki, 10-200μlGreiner Bio-One GmbH739296
Probówki reakcyjne 1,5mlGreiner Bio-One GmbH616201
Probówki reakcyjne 2mlGreiner Bio-One GmbH623201
Bakteriologiczna szalka Petriego, 94x16mmGreiner Bio-One GmbHNumer katalogowy: 633180
Sokół 15mlGreiner Bio-One GmbH188271
Sokół 50mlVWR International GmbH (BD)Nr kat. 734-0448
Hemocytometr NeubaueraBiochrom AGZestaw PDHC-N01
żyletkaCarl Roth GmbHCK07.1
szt. powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ischemic Mouse BrainCell Suspension IsolationEnzymatic DigestionDensity Gradient CentrifugationImmune Cell AnalysisFlow CytometryTissue MincingCell FiltrationMyelin RemovalDebris Separation

Powiązane artykuły