Indukcja dyskinez wywołanych lewodopą w szczurzym modelu choroby Parkinsona

Streszczenie

Źródło: Caulfield, M. E., et al. Indukcja i ocena dyskinez wywołanych lewodopą w szczurzym modelu choroby Parkinsona. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film pokazuje proces wywoływania dyskinez wywołanych lewodopą w modelu szczurzym z chorobą Parkinsona poprzez podawanie lewodopy wraz z inhibitorem konwersji dopaminy. Powtarzające się zastrzyki nadmiernie stymulują neurony mózgu, powodując dysfunkcję motoryczną.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przygotowanie odczynników i zapasów

1. Oznaczyć chlorowodorek estru metylowego estru metylowego L-3,4-dihydroksyfenyloalaniny (lewodopa lub L-DOPA) i chlorowodorek benzerazydu, obwodowy inhibitor dekarboksylazy (patrz tabela materiałów), częstość oceny i harmonogram eksperymentu, który jest odpowiedni dla pytania badawczego (ryc. 1).
   nuta: Można zadawać pytania badawcze w celu poszukiwania dowolnej liczby odpowiedzi, począwszy od pytania, czy konkretna terapia może zmniejszyć istniejące dyskinezy wywołane przez L-DOPA (LID), a skończywszy na zapobieganiu indukcji LID. Mogą również zbadać, czy skuteczność terapeutyczna zależy od dawki lewodopy, czy też ekspresja LID i/lub skuteczność terapeutyczna różnią się w zależności od płci, gatunku i wieku pacjenta.
2. Waż szczury co tydzień, aby obliczyć odpowiednią ilość leku na podstawie zmian masy ciała zachodzących podczas badania.
   nuta: Ze względu na zwiększoną aktywność u szczurów LID+, istnieje możliwość utraty wagi przy długotrwałych zabiegach L-DOPA. Jeśli nastąpi utrata masy ciała, zapewnij szczurom kompletne pod względem odżywczym, bardzo smaczne smakołyki (patrz tabela materiałów) po wstrzyknięciach L-DOPA.
3. Obliczyć ilość L-DOPA i benzerazydu wymaganą dla każdego tygodniowego stężenia, odważając liofilizowane podwielokrotności na każdy dzień wstrzyknięcia i przechowując w skojarzeniu przez 1–2 tygodnie w temperaturze -20 °C w szklanych bursztynowych fiolkach do dnia poddawania działaniu substancji.
   nuta: Docelowa dawka wynosi 12 mg/kg lub 12 mg L-DOPA/1000 g masy ciała. Informacje uzupełniające zawierają przykład obliczeń służących do określania ilości L-DOPA i soli fizjologicznej potrzebnej na każdy dzień tygodnia przy użyciu 12 mg L-DOPA/kg masy ciała przy objętości wstrzyknięcia 1 cm3/kg masy ciała szczura.

2. Ustawienie pomieszczenia i klatki

1. W pierwszym dniu leczenia L-DOPA, 3-4 tygodnie po operacji zmiany 6-hydroksydopaminy (6-OHDA), należy przenieść szczury do pojedynczego pomieszczenia, w tym wzbogacenia zatwierdzonego przez IACUC.
2. Utrzymuj w pojedynczym mieszkaniu przez cały czas trwania badania, aby uniknąć ingerencji rówieśników w oceny zachowania.
3. W dniach, w których obowiązuje ocena LID, umieść klatki domowe na stalowym stojaku z drutu, obróconym pod kątem około 45°, aby uzyskać optymalne view szczura (Rysunek 2A). Odwróć znaczniki identyfikacyjne (Rysunek 2B) do góry i wyjmij butelki z wodą, stojaki na żywność i wszelkiego rodzaju urozmaicenie w klatce (Rysunek 2C), aby uniknąć zakłóceń w ocenach zachowania.

3. Ocena zastrzyków z lewodopy i dyskinezy

1. Iniekcje podskórne L-DOPA
   1. Bezpośrednio przed codziennym wstrzyknięciem L-DOPA dodaj odpowiednią objętość sterylnego roztworu soli fizjologicznej do wstępnie zważonej liofilizowanej mieszaniny L-DOPA i benzerazydu w bursztynowej fiolce i dobrze wstrząsaj przez 10 s (krok 1.3).
      UWAGA: Docelowa objętość wstrzyknięcia wynosi 1 ml/1000 g masy ciała (przy 12 mg L-DOPA na ml). Objętość sterylnego roztworu soli fizjologicznej będzie zależeć od liczby zwierząt w badaniu.
   2. Napełnić poszczególne strzykawki (np. 1,0 lub 0,5 ml igłą 26 G) wymaganą objętością dla każdego zwierzęcia (1 ml/kg masy ciała szczura) i oznaczyć każdą strzykawkę indywidualnym identyfikatorem zwierzęcia.
      nuta: Napełnione strzykawki należy chronić przed światłem w sterylnych torebkach do czasu wstrzyknięcia. L-DOPA szybko utlenia się w obecności tlenu i światła w środowisku wodnym.
   3. Przynieś pierwszą klatkę na stół do wstrzykiwań.
   4. Wyjąć szczura z klatki i umieścić go na powierzchni wstrzyknięcia.
   5. Delikatnie przymocuj głowę i ramiona do powierzchni, na której spoczywa szczur, dłonią ręki niedominującej.
   6. Delikatnie posmaruj skórę na plecach pokrywającą łopatki kciukiem i palcem wskazującym ręki niedominującej. Następnie wstrzyknąć objętość L-DOPA dominującą ręką w przestrzeń podskórną między palcami / pod palcami, trzymając igłę jak najbardziej równolegle do ciała, aby uniknąć wstrzyknięcia domięśniowego.
      nuta: Szczury nie są znieczulane przed wstrzyknięciem.
   7. Każdą zużytą strzykawkę należy wyrzucić do ostrego pojemnika.
   8. Umieść szczura w jego indywidualnej klatce i dodaj kompletne pod względem odżywczym smakołyki, z wyjątkiem dni oceny LID, aby uniknąć zakłóceń w ocenach behawioralnych do czasu zakończenia ocen.
   9. Ustaw timer na 1–2 minuty w zależności od żądanego czasu oceny i liczby szczurów w badaniu w dniach oceny. Odzyskaj następną klatkę i wstrzyknij następnego szczura, gdy wskaże to zegar.
   10. Powtórz to, wstrzykując jednego szczura co 1-2 minuty, aż wszystkie szczury zostaną wstrzyknięte.
2. Ocena dyskinezy wywołanej lewodopą po wstrzyknięciu
   1. Oceń intensywność (Tabela 1) i częstotliwość (Tabela 2) ruchów dyskinezy dystonicznej i hiperkinetycznej w pożądanej liczbie punktów czasowych, które powinny obejmować początkowy początek zachowania LID, zachowanie szczytowe i fazę spadku.
   2. W przypadku samców i samic dorosłych szczurów Sprague Dawley lub Fisher 344 i wielkości próbki N = 40 szczurów, rozpocznij ocenę dyskinezy 20 minut po pierwszym wstrzyknięciu L-DOPA, a następnie w odstępach 50-minutowych do 220 lub 270 minut po wstrzyknięciu, w zależności od tego, kiedy zachowania LID ustąpiły u 90%-100% szczurów.
   3. Jeśli używasz 1-minutowych interwałów oceny, ustaw minutnik na 1 minutę. Oceń pierwszego szczura na jedną minutę. Przejdź do następnego szczura i oceniaj go przez 1 minutę. Kontynuuj przez wszystkie szczury, oceniając w odstępach 1-minutowych.
   4. Zegar powinien być umieszczony obok klatki w widocznym miejscu, tak aby można było zaobserwować intensywność zachowania LID (Tabela 1) podczas szacowania częstotliwości dowolnego zachowania (Tabela 2) w okresie oceny.
   5. Po zakończeniu oceny dla pierwszego punktu czasowego rozpocznij ponownie z pierwszym szczurem w następnym punkcie czasowym (np. 70 minut po wstrzyknięciu) i kontynuuj w żądanym odstępie czasu (np. co 50 minut), aż wszystkie punkty czasowe zostaną ukończone.
      nuta: Ze względu na nakładanie się zadań związanych z wstrzykiwaniem L-DOPA i oceną LID, w dniach oceny potrzebne są dwie osoby, jedna do wstrzykiwania i jedna do ocen behawioralnych.

Wyniki

Rycina 1: Przykładowy harmonogram leczenia. Przykładowa oś czasu eskalacji dawki L-DOPA wynosząca 12 tygodni całkowitej długości, z 8 tygodniami wstrzykiwań L-DOPA rozpoczynających się 3 tygodnie po zmianie 6-OHDA i 4 tygodnie po leczeniu eksperymentalnym. W tym przykładzie L-DOPA jest wstrzykiwana podskórnie 5 razy w tygodniu (od poniedziałku do piątku) mniej więcej o tej samej porze każdego dnia, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100-minutowy zegar cyfrowy	Zszywki	1111764
Kompas CX Waga kompaktowa	Ohaus	30428202
5-(2-aminoetylo)-1,2,4-benzenotriol, monohydrobromek	Chemikalia na Kajmanach	Numer katalogowy: 25330	6-OHDA jest neurotoksyną katecholaminergiczną, która jest stosowana do wywoływania zmian dopaminergicznych i objawów parkinsonowskich u gryzoni
Klatki Allentown	Allentown, Sp. z o.o	Szczur900 powiedział	Klatki Allentown dają możliwość oglądania szczurów ze wszystkich stron.
Tacki dla alergików BD z igłą przymocowaną na stałe	Bd	BD 305540	Do podskórnych wstrzyknięć L-DOPA
Chlorowodorek benzerazydu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał B7283	Benzerazyd jest obwodowym inhibitorem dekarboksylazy stosowanym z L-DOPA w celu wywołania dyskinezy w modelach PD u gryzoni
Szklane bursztynowe fiolki scyntylacyjne	Thermo Scientific	Zobacz materiał B7921	Służy do przechowywania L-DOPA/benzerazydu w temperaturze -20 °C do czasu zmieszania ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
Chlorowodorek estru metylowego L-3,4-dihydroksyfenyloalaniny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D1507	Ester metylowy L-3,4-dihydroksyfenyloalaniny jest prekursorem L-DOPA, który przenika przez barierę krew-mózg i jest stosowany w leczeniu objawów parkinsonowskich u gryzoni.
Ołówki automatyczne Paper Mate Sharpwriter	Zszywki	Numer katalogowy: 107250
Kompletne odżywcze smakołyki wzbogacające składniki odżywcze dla gryzoni	Bio-Serv	F05478
Okrągłe wiaderko na lód z pokrywką, 2,5 l	Corning	432129
Standardowy plastikowy schowek	Zszywki	1227770
Ruchome regały z drutem stalowym o długości 6 stóp	Uline powiedział:	Zobacz materiał H9488	Szerokość/wysokość można dostosować do potrzeb/liczby szczurów na eksperyment
Sterylna sól fizjologiczna 0,9%	Covidien/Argyle	Numer katalogowy 1020	Do mieszania z L-DOPA/bens

powiedział: . . : TGL . powiedział: TGL