Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Charakterystyka starzenia się neuronów w organoidach korowych
- Organoidy korowe do kriosekcji:
UWAGA: Kroki zostały wykonane w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2.
- Przygotuj 2 ml probówek, z których każda wypełniona jest 1,5 ml 4% paraformaldehydu (PFA).
- Odetnij koniec końcówki pipety P1000 (aby uzyskać szeroki otwór) i delikatnie przenieś każdy organoid do jednej z przygotowanych powyżej probówek o pojemności 2 ml (po jednym organoidzie na probówkę).
UWAGA: Aby zapobiec mieszaniu się nadmiaru pożywki DM z PFA, pozwól organoidowi opaść w kierunku otworu końcówki pipety P1000 i oprzyj końcówkę tuż nad górną częścią PFA w probówce przed odpipetowaniem organoidu. Umożliwi to badaczowi przeniesienie tylko organoidu i bardzo minimalnej ilości pożywki.
- Pozwól, aby proces utrwalania odbywał się w temperaturze 4°C przez 1 h.
- Używając nieobciętej końcówki pipety P1000, ostrożnie odessać nadmiar PFA i dodać 1,5 ml zimnego 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
- Przenieś probówki do wytrząsarki orbitalnej ustawionej na 70 obr./min na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Powtórz proces mycia z zimnym 1x PBS trzy razy, aby upewnić się, że cały PFA został dokładnie usunięty.
UWAGA: Nie wyrzucaj PFA do zwykłych pojemników na odpady; zamiast tego przygotuj do tego specjalny pojemnik na odpady chemiczne, ponieważ PFA stanowi zagrożenie.
- Zanurzyć organoidy w 1x PBS zawierającym 30% sacharozy i inkubować w temperaturze 4 °C, aż wszystkie organoidy opadną na dno probówki.
UWAGA: Czas potrzebny do zatonięcia organoidów zależy od ich wielkości i wieku. Trzymiesięczne organoidy mogą potrzebować do 5 godzin.
- Za pomocą naciętej końcówki do pipety P1000 o szerokim otworze delikatnie przenieś od trzech do pięciu organoidów do formy montażowej zawierającej roztwór montażowy wykonany z 30% sacharozy i pożywki o 100% optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w stosunku 3:2.
- Użyj końcówki do pipety o pojemności 10 μl za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby zorientować i ustawić organoidy w kształcie siatki.
- Umieść formę na suchym lodzie, aby zestalić roztwór sacharozy OCT przed przystąpieniem do kriosekcji (16-20 μm) za pomocą kriostatu.
UWAGA: W przypadku beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się, wszystkie tkanki muszą zostać przetworzone do sekcji po ich zatonięciu. W celu immunofluorescencji tkanki można przetworzyć do sekcji następnego dnia. Jeżeli nie zostaną natychmiast wybarwione, wszystkie szkiełka zawierające skrawki muszą być przechowywane w temperaturze -20 °C przed późniejszą immunofluorescencją lub beta-galaktozydazą.
- Proces analizy starzenia się organoidów korowych mózgu:
UWAGA: Poniższe kroki można wykonać na zwykłym stole laboratoryjnym.
- Przenieść szkiełka do pojemnika do barwienia szkiełek mikroskopowych z pokrywką i umyć podzieloną tkankę organoidową trzykrotnie 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar roztworu montażowego.
- Następnie inkubować umytą tkankę ze świeżo przygotowanym roztworem barwiącym beta-galaktozydazę przez noc w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Roztwór do barwienia beta-galaktozydazy składa się z buforu fosforanowego (na 10 ml buforu fosforanowego: 8,15 ml 1 M NaH2PO4, 1,85 ml 1M Na2HPO4) o dostosowanym pH = 6,100 mM heksacyjanożelazianu (III) potasu, 100 mM trójwodzianu heksacyjanożelazianu (II) potasu, 5 M NaCl, 1 M MgCl2, 20 mg/ml X-Gal. Unikaj używania standardowego inkubatora do hodowli komórkowych zawierającego CO2, ponieważ CO2 zmieni pH roztworu barwiącego beta-galaktozydazę.
- Aby usunąć roztwór beta-galaktozydazy, przemyj poplamione tkanki 1x PBS trzy razy przez 10 minut każda w RT.
- Zamontuj umyte chusteczki za pomocą szklanego środka mocującego zapobiegającego blaknięciu i pozwól roztworowi montażowemu zestalić się przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed obejrzeniem pod mikroskopem.
