Napady wywołane obsługą w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Batot, G., et al. Model padaczki o etiologii zakaźnej z wykorzystaniem wirusa mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film pokazuje indukcję napadów wywołanych obsługą u myszy zakażonej wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV). Zarażona mysz, która ma nadpobudliwe neurony, jest narażona na zewnętrzne bodźce fizyczne. To narażenie powoduje stres, co prowadzi do nieprawidłowej aktywności elektrycznej neuronów, co skutkuje drgawkami.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Szczepienie wirusem

1. Sterylizacja strzykawki iniekcyjnej
   1. Zdjąć nakrętkę strzykawki insulinowej. Dodać rurkę polietylenową jako kołnierz wokół igły, aby zapewnić odpowiednią głębokość wstrzyknięcia 2,5 mm. Zanurzyć strzykawkę w etanolu na 30 minut. Umieść strzykawkę w świetle UV na 30 minut.
   2. Założyć nasadkę z powrotem na igłę. Zawinąć strzykawkę w woreczek sterylizacyjny i zakleić taśmą klejącą. Etykieta z datą przygotowania.
2. Wstrzyknięcie wirusa
   1. Pobierz porcje szczepu TMEV Daniela z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Rozmrozić wirusa i trzymać go na lodzie. Unikaj rozmrażania i ponownego zamrażania wirusa. Umieścić w strzykawce zawiesinę wirusa (3 x 10⁵ jednostka tworząca blaszkę [PFU] rozcieńczona w 20 μl buforowanej fosforanami soli fizjologicznej [PBS] lub zmodyfikowanej pożywki hodowlanej Eagle [DMEM] firmy Dulbecco).
      UWAGA: Wirus jest zakaźny dla myszy, ale nie dla ludzi.
   2. Wyczyść ławkę środkiem dezynfekującym i pracuj pod pochłaniaczem oparów. Inokulacja wirusa nie jest sterylna, ale jest tak czysta, jak to tylko możliwe.
   3. Przenieś mysz do komory indukcyjnej znieczulenia i użyj 2% izofluranu w tlenie do wywołania znieczulenia. Osiągnięcie tolerancji chirurgicznej zajmuje kilka minut; Dostosuj stężenie w zależności od oddechu zwierzęcia i głębokości znieczulenia.
   4. Przenieś znieczuloną mysz z pudełka anestezjologicznego pod maskę. Sprawdź tolerancję chirurgiczną, np. poprzez uszczypnięcie palca u nogi. Cała procedura wykonywana jest w czasie krótszym niż 30 sekund, dzięki czemu zwierzę nie musi wdychać izofluranu podczas iniekcji. Dodaj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
   5. Oczyść głowę zwierzęcia wacikiem nasączonym alkoholem. Lekko przechylić głowę myszy w lewo, tak aby miejsce wstrzyknięcia było skierowane do góry.
   6. Pociągnąć skórę nieco do tyłu, wprowadzić igłę do głowy i wstrzyknąć 20 μl śródkorowo na głębokość 2,5 mm w okolicę skroniową prawej półkuli (z tyłu i przyśrodkowo do prawego oka).
   7. Wstrzyknięcie należy wykonać jednostronnie w tę samą półkulę u wszystkich zwierząt. Użyj oka i ucha jako punktów orientacyjnych dla lokalizacji kory ciemieniowej. Umiejscowienie zostało wcześniej zweryfikowane histologicznie; patrz Rysunek 1. Współrzędne iniekcji zgodnie z iniekcją stereotaktyczną w stosunku do bregmy wynoszą −2,0 (AP); +3,0 (ML); −1,5 (DV).
   8. Pozostawić strzykawkę na miejscu na 5-15 sekund. Zanotować, czy nie ma wycieku z wstrzyknięcia lub czy widoczne są pęcherzyki powietrza - w takim przypadku należy przygotować nową strzykawkę. Ostrożnie wyciągając strzykawkę, należy ją lekko obrócić. Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu pod narkozą.
   9. OPCJONALNIE: Zakoduj zwierzę na ogonie lub uchu w zależności od lokalnych procedur (opcjonalnie, ale łatwo, ponieważ zwierzę jest nieprzytomne).
   10. Przenieść zwierzę do nowej klatki, która jest umieszczana w połowie na poduszce grzewczej (35-40 °C) podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
       UWAGA: Zwierzęta mogą być ponownie trzymane w grupach po wyzdrowieniu (zarażone zwierzęta nie są mieszane ze zwierzętami pozorowanymi zarażonymi). Zakażone myszy nie powinny być trzymane w tym samym pomieszczeniu co myszy niezakażone.
   11. Śledź wagę myszy przez pierwsze 7 dni po zakażeniu, ponieważ tracą na wadze po infekcji i mogą wymagać dodatkowego karmienia.

2. Monitorowanie napadów padaczkowych wywołanych przez postępowanie z chorobowaniem

1. Wykonaj tę procedurę przez eksperymentatora ślepego na leczenie. Przynieś wszystkie klatki na ławkę. Obserwuj zwierzęta pod kątem napadów padaczkowych 2 razy dziennie w fazie światła.
2. Oceń aktywność napadową za pomocą zmodyfikowanej skali Racine'a: 0 = brak zmian w zachowaniu, 1 = ruchy ust i twarzy, 2 = kiwanie głową, 3 = jednostronne klonus kończyn przednich, 4 = obustronny klonus kończyny przedniej z odchodem, 5 = uogólniona aktywność toniczno-kloniczna z utratą tonu posturalnego, czasami skakanie, 6 = długotrwałe i nadmierne skakanie oraz nadpobudliwość. Zgłaszaj liczbę i intensywność napadów.
3. Przesuń długopis po klatce, aby narobić trochę hałasu.
4. Przenieś każde zwierzę do innego pudełka i z powrotem.
5. Delikatnie potrząśnij klatką ruchem w przód iw tył, uważając, aby nie potrząsnąć klatką tak energicznie, że zwierzęta uderzą w boki lub górę klatki i będą narażone na obrażenia fizyczne.
6. Monitoruj wszystkie zwierzęta w klatce pod kątem napadów. W dowolnym momencie, jeśli mysz ma napad, przenieś ją z powrotem do klatki domowej i zapisz poziom napadu bez dalszej stymulacji napadu poprzez hałas lub obchodzenie się.
7. W przypadku zwierząt, które nie chwyciły się samoistnie lub po delikatnym potrząśnięciu klatką, wywołaj drgawki poprzez bardziej intensywne obchodzenie się: Ostrożnie odwróć mysz, obracając ją za ogon od lewej do prawej.
   UWAGA: Zwierzęta z napadami padaczkowymi są nadpobudliwe i mogą być nerwowe.
8. Ponownie obserwuj każde zwierzę pod kątem napadów. Powtórz ten proces dla kolejnych klatek.

Wyniki

Rycina 1: Schemat procedury wstrzykiwania TMEV. Od lewej do prawej: W przypadku wstrzyknięcia prawej kory ciemieniowej igłę wstrzykuje się nieco z boku wyimaginowanej linii między okiem a uchem przeciwnym. Kołnierz do kontroli głębokości jest oznaczony kolorem żółtym. Droga iniekcyjna jest widoczna w koronalnym odcinku mózgu, oznaczonym strzałką. Miejsce wstrzyknięcia odpowiada współrzędnym podanym n...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Równowaga zwierząt	Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.)	STX2202	0,01 g–2200 g
Strzykawki do insuliny BD Lo-Dose U-100	BD (Mississauga, ON, Kanada)	BD329461	Sterylne strzykawki Lo-Dose ze stałą igłą dożylną BD Micro-Fine - 1 mL
Szczep TMEV Daniela	dzięki uprzejmości Roberta Fujinami (University of Utah)	-	3 x 105 jednostek tworzących płytkę nazębną podwielokrotność(i)
Środek dezynfekujący, np. VennoVet 1 super	Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Niemcy	-	Polecany przez weterynarzy kampusu o zawartości alkoholu mniejszej lub równej 5%
Fisherbrand średnio sterylny walet nasączony alkoholem C7	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone)	22-363-750
Fluriso	VETone (Boise, ID, Stany Zjednoczone)	502017	Izofluran 250 ml, 2%–5%
Pochłaniacz oparów	Labconco (Kansas City, Missouri, Stany Zjednoczone)	-	-
Jednorazowe białe fartuchy laboratoryjne SMS do ogólnej ochrony	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone)	17-100-810A
Wiadro na lód	-	-	any
Klatka dla myszy	-	-	dowolna klatka dla myszy z co najmniej 5 myszami
Igły PrecisionGlide	BD (Mississauga, ON, Kanada)	329652	BD Slip Tip z igłą Strzykawki do insuliny PrecisionGlide - 26 G x 3/8 - 0,45 mm x 10 mm
Samouszczelniająca się torebka sterylizacyjna	Fisher Scientific (Hampton, Nowy Jork, Stany Zjednoczone)	NC9241087	12,6 x 25,5 cm
Mała szklana kolba	-	-	any, objętość 25 mL
sterylny PBS	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone)	10010056
Strzykawka Luer-Lok	BD (Mississauga, ON, Kanada)	309628	1 ml strzykawki
Myjka ultradźwiękowa, grzałka/zegar mechaniczny	Cole-Parmer (Vernon Hills, Illinois, Stany Zjednoczone)	EW-08895-23	Sonikator do kąpieli - 0,5 gal, 115 V