$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie roztworu lizofosfatydylocholiny (LPC)
- Rozpuścić 25 mg proszku LPC (patrz Tabela materiałów) w 250 μl zmieszanego roztworu chloroformu i metanolu (1:1) w celu uzyskania 10% roztworu LPC i przenieść go do probówki wirówkowej o pojemności 500 μl.
UWAGA: Jeśli LPC nie jest całkowicie rozpuszczony, umieść probówkę wirówkową w myjce ultradźwiękowej i ultradźwięki pod ciśnieniem 40 kHz przez ~1 h, aby uzyskać jednolity roztwór.
- Podzielić roztwór na 3 μl/probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Roztwór może być przechowywany przez ~2 lata.
- Przed zabiegiem należy rozcieńczyć roztwór (krok 1.2) 27 μl 0,9% roztworu chlorku sodu (NaCl) i przechowywać roztwór w łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 °C.
UWAGA: Przygotuj roztwór tuż przed rozpoczęciem wstrzyknięcia.
2. Przygotowanie chirurgiczne
- Użyj igły o wadze 32 G, 2 cale, aby połączyć się ze strzykawką o pojemności 5 μl (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że strzykawka z mikrolitrami jest drożna. Pobrać 5 μl roztworu LPC w celu przygotowania wstrzyknięcia.
- Znieczulenie myszy w komorze indukcyjnej podłączonej do parownika izofluranu z 3% izofluranem zmieszanym ze 100% tlenem z szybkością około 0,3 l/min.
- Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp, gdy oddech jest płynny.
- Ogol głowę myszy między uszami za pomocą golarki elektrycznej. Zastosuj nawilżające krople do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.
- Następnie ustaw mysz w ramce stereotaktycznej (patrz Tabela materiałów) grzbietem do góry i zabezpiecz głowę stożkiem nosowym i zaciskiem zębowym. Utrzymuj znieczulenie z 1,2%-1,6% izofluranem przez nos.
UWAGA: Stężenie izofluranu można dostosować do stanu oddechowego myszy.
3. Zabieg chirurgiczny
UWAGA: Zwierzęta są umieszczane na poduszce grzewczej podczas wszystkich zabiegów.
- Przymocuj mysz do aparatu stereotaktycznego za pomocą obustronnych nauszników. Upewnij się, że nauszniki są wypoziomowane, a głowa jest pozioma i stabilna.
- Zdezynfekuj skórę na głowie, przecierając ją kilkakrotnie jodoforem, a następnie alkoholem okrężnymi ruchami. Następnie skalpelem wycina się małe nacięcie o długości około 1,5 cm wzdłuż linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.
- Przetrzyj czaszkę bawełnianym wacikiem zamoczonym w 1% nadtlenku wodoru, aż bregma, lambda i tylne ciemiączko zostaną odsłonięte. Umieścić strzykawkę na aparacie stereotaktycznym.
UWAGA: Używaj wody utlenionej ostrożnie i unikaj dotykania otaczających tkanek.
- Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest ułożona w poziomie (zarówno przód, jak i tył oraz lewo i prawo).
- Wyreguluj pokrętło osi Z ramy stereotaktycznej tak, aby końcówka igły i czaszka po prostu stykały się bez zginania, a następnie zmierz współrzędną osi Z. Sprawdź współrzędne Z bregmy i ciemiączka tylnego.
- Wyreguluj listwę douszną tak, aby różnica między współrzędnymi Z bregmy i ciemiączka tylnego nie przekraczała 0.02 mm. Następnie postępuj zgodnie z tą samą metodą, aby zmierzyć współrzędne Z odpowiednich pozycji po lewej i prawej stronie linii środkowej. Wyreguluj pasek douszny, aby upewnić się, że lewy i prawy są na tym samym poziomie.
- Zlokalizuj ciało modzelowate. Ustaw początek układu współrzędnych XYZ na bregma.
UWAGA: Pierwsze miejsce wstrzyknięcia znajduje się 1,0 mm bocznie do bregmy, 2,4 mm głębokości i 1,1 mm z przodu. Drugie miejsce wstrzyknięcia znajduje się 1,0 mm bocznie w stosunku do bregmy, na głębokości 2,1 mm i 0,6 mm z przodu. Na przykład współrzędna bregmy to (0,0,0). Zmierz współrzędną Z odpowiedniego położenia oznaczonego jako (-1, 1.1, X) i (-1, 0.6, Y). Można określić współrzędną pierwszego miejsca wstrzyknięcia ciała modzelowatego (-1, 1,1, −[X + 2,4]), a drugiego miejsca wstrzyknięcia (-1, 0,6, −[Y + 2,1]).
- Po ustaleniu miejsca wstrzyknięcia należy wykonać na czaszce znak sterylnym markerem i zapisać współrzędne.
- Delikatnie przewierć oznaczone miejsce wiertłem do czaszki (patrz Tabela materiałów). Należy uważać, aby uniknąć krwawienia.
- Powoli przesunąć igłę do podanych współrzędnych i rozpocząć wstrzykiwanie. Aby wywołać demielinizację ciała modzelowatego, wstrzyknąć 2 μl roztworu LPC (krok 1.2) w każde miejsce wstrzyknięcia (krok 3.5.) z szybkością 0,4 μl/min.
- Po wstrzyknięciu należy trzymać igłę w każdym miejscu przez dodatkowe 10 minut.
UWAGA: Upewnij się, że odstęp między dwoma wstrzyknięciami nie przekracza 20 minut.
- Zszyj skórę szwem 4-0 i poczekaj, aż zwierzę obudzi się w ciągu 10 minut. Leki przeciwbólowe należy podawać pooperacyjnie zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
UWAGA: Zalecany czas eutanazji można określić w zależności od celu eksperymentu.