Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.
Artykuł metodologiczny
Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Odwłok poczwarki Drosophila jest uznanym modelem badawczym w analizie morfogenezy nabłonkowej oraz rozwoju morfologii wykazujących dymorfizm płciowy 1-3. Podczas poczwarzenia, które trwa około 96 godzin (w 25 °C), proliferujące populacje komórek imaginalnych zastępują larwalny naskórek, tworząc dorosłe segmenty odwłoka. Komórki imaginalne te, powstające podczas embriogenezy, występują w formie bocznych par gniazd histoblastów w każdym segmencie odwłoka larwy. Cztery pary gniazd histoblastów dają początek dorosłej kutykuli grzbietowej (gniazda grzbietowe przednie i tylne), kutykuli brzusznej (gniazda brzuszne) oraz przetchawicznym otworom związanym z każdym segmentem (gniazda spirakularne) 4. Po przejściu w stadium poczwarki komórki diploidalne te (odróżnialne wielkością od większych poliploidalnych komórek naskórka larwalnego – LECs) rozpoczynają stereotypowy proces proliferacji, migracji i zastępowania LECs. Do badania roli szlaków genetycznych zaangażowanych w morfogenezę dorosłego odwłoka można wykorzystać różnorodne narzędzia molekularne i genetyczne. Ostateczne fenotypy osobników dorosłych analizuje się zazwyczaj po wypreparowaniu kutykuli odwłoka dorosłego owada. Jednak badanie leżących u podstaw procesów molekularnych wymaga analiz immunohistochemicznych nabłonka poczwarki, co wiąże się z określonymi trudnościami. Dynamiczna czasowo morfogeneza oraz interakcje dwóch odrębnych populacji nabłonkowych (larwalnej i imaginalnej) tworzą kruchą tkankę podatną na nadmierną utratę komórek podczas dysekcji i późniejszego przetwarzania. Opracowaliśmy metody dysekcji, utrwalania, montowania i obrazowania nabłonka odwłoka poczwarki Drosophila do badań immunohistochemicznych, które pozwalają na uzyskanie spójnych, wysokiej jakości próbek odpowiednich do mikroskopii konfokalnej lub standardowej mikroskopii fluorescencyjnej.
Protokół
1. Dzień 1
Przed rozpoczęciem:
Zdrową populację much należy utrzymywać zgodnie ze standardowymi protokołami hodowlanymi: osobniki dorosłe należy usunąć z butelek lub fiolek po 3-4 dniach od zniesienia jaj i pozwolić na rozwój w stałej temperaturze, aż wędrujące larwy 3rd stadium rozpoczną pupariację. Przejście ze stadium larwalnego w poczwarkowe jest zaznaczone przez formowanie się przedpoczwarków (przyjmowane jako 0 godzin po formowaniu puparium-APF). Nieruchome poczwarki odróżnia się od starszych poczwarek białym zabarwieniem, a od larw, które nie rozpoczęły jeszcze pupariacji, podłużnym, zaokrąglonym kształtem oraz wystawaniem przetchlinek przednich.
Będziesz potrzebować:
- Pędzel do zbierania poczwarek
- Komora wilgotna do hodowli poczwarek: szalka Petri wyłożona zwilżonym ręcznikiem papierowym i przykryta papierem filtrującym, oznakowana zgodnie z różnymi punktami czasowymi zbioru, genotypem lub płcią poczwarek
- 1X roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do przemywania poczwarek
Zbiór, hodowla i wyznaczanie stadium poczwarek
- Używając zwilżonego pędzla, delikatnie przenieś poczwarki w 0 godzin APF z butelek/fiolek hodowlanych i umieść je w pokrywie komory wilgotnościowej.
- Za pomocą pędzla i 1X PBS delikatnie obmyj poczwarki, aby usunąć zanieczyszczenia z poczahwy
- W razie potrzeby posegreguj poczwarki według płci. Do segregacji płci można wykorzystać przymordyt gonad poczwarek. Przymordyty gonad samców stanowią boczna para przezroczystych dysków, łatwo widocznych przez kutykulę poczwarki w około 2/3 długości ciała 5. Przymordyty gonad samic są mniejsze i trudniejsze do zidentyfikowania.
- Umieść poczwarki w odpowiednio oznakowanych miejscach w komorze wilgotnościowej i przywróć stałą temperaturę. Hoduj do odpowiedniego punktu czasowego rozwoju.
2. Dzień 2: Disekcja, fiksacja i inkubacja z przeciwciałem pierwotnym
Przed rozpoczęciem:
Będą potrzebne:
- Stereomikroskop sekcyjny
- Pincety chirurgiczne
- Skalpel chirurgiczny z ostrzami nr 11
- Dwie szklane płytki z dziewięcioma wgłębieniami (Corning produkt # 7220-85)
- Wypełnij wgłębienia jednej płytki 1X PBS: służy ona do płukania wypreparowanych poczwarek
- Wypełnij wgłębienia drugiej płytki buforem utrwalającym
- Komora wilgotna do inkubacji przeciwciał. Stosujemy plastikowe szczelne pojemniki śniadaniowe wyłożone zwilżonymi ręcznikami papierowymi.
- Bufor utrwalający: 1x PBS, 4% paraformaldehydu, 0,2% kwasu deoksycholowego (do permeabilizacji)
- Platforma sekcyjna: czyste szkiełko przedmiotowe z przyklejonym do jednej strony kawałkiem taśmy dwustronnej
- 1X PBS
- Pipeta p100 lub p200
Disekcja
- Używając pęsety, delikatnie wyjmij poczwarki pojedynczo i umieść je na platformie do sekcji, tak aby przedni koniec poczwarki był skierowany w stronę najszerszej krawędzi taśmy. Jeśli poczwarki są zbyt mokre, najpierw osusz je ręcznikiem papierowym.
- Zanim poczwarki całkowicie przylgną do taśmy, użyj pędzla, aby je odpowiednio ustawić.
- Pozostaw poczwarki do wyschnięcia na powietrzu i przywarcia do taśmy (5-10 minut).
- Za pomocą skalpela chirurgicznego przetnij każdą poczwarkę bilateralnie. Najlepiej wykonać to jednym szybkim cięciem od przedniego do tylnego końca poczwarki. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, cięcie przetnie obie pary przetchwyków przednich i tylnych. Sekcjonuj nie więcej niż 10 poczwarek jednocześnie, ponieważ szybkie mycie i oczyszczanie próbek jest niezbędne, aby zapobiec proteolitycznemu uszkodzeniu tkanek.
- Używając pędzla, przenieś niewielką ilość 1X PBS na każdą rozciętą poczwarkę, aby odkleić je od taśmy.
Czyszczenie, fiksacja i inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
- Za pomocą pęsety chirurgicznej chwyć połowę przedniej części pojedynczej poczwarki i natychmiast zanurz ją w dołku naczynia do płukania. Platformę do sekcji na stoliku mikroskopu należy zastąpić naczyniem do płukania. Pokrywa poczwarek powinna pozostać na próbce do czasu zakończenia obróbki i przygotowania próbek do montowania.
- Trzymając nadal połowę poczwarki, użyj pipetora, aby delikatnie wypłukać tkanki wewnętrzne odwłoka. Zbyt duże ciśnienie podczas płukania może doprowadzić do utraty komórek nabłonkowych.
- Bezzwłocznie przenieś oczyszczoną połowę poczwarki do buforu utrwalającego w temperaturze pokojowej i w ten sam sposób opracuj pozostałe połowy poczwarek. Dzięki praktyce sekcja i płukanie 20 połówek poczwarek powinno zająć mniej niż 5 minut.
- Inkubuj poczwarki w buforze utrwalającym w temperaturze pokojowej przez 1 (jedną) godzinę.
- Płucz utrwalone poczwarki 3x przez pięć minut w 1X PBS.
- Próbki można natychmiast poddać obróbce w celu przeprowadzenia immunohistochemii lub przechowywać w 100% etanolu w temperaturze -20°C do 3 miesięcy bez utraty komórek lub reaktywności epitopów.
- Aby przechowywać próbki, należy je równoważyć poprzez serię rozcieńczeń PBS:EtOH (3:1, 1:1, 1:3) w temperaturze pokojowej przez 20 minut w każdym rozcieńczeniu przed przeniesieniem do 100% EtOH.
- Przed przystąpieniem do immunohistochemii próbki muszą zostać ponownie zrównoważone w PBS poprzez odwrotną serię rozcieńczeń.
- Blokuj próbki w 1x PBS (z dodatkiem 2% albuminy surowicy bydlęcej) przez 1 (jedną) godzinę przed dodaniem przeciwciała pierwszorzędowego.
- Inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym do odpowiedniego stężenia w 1X PBS przez noc w temperaturze 4°C bez kołysania.
3. Dzień 3: Inkubacja z przeciwciałem wtórnym, montowanie i obrazowanie
Przed rozpoczęciem:
Będziesz potrzebować:
- Dwie pęsety chirurgiczne
- Media montażowe (glicerol, Vectashield [Vector Labs] lub Slowfade Gold [Invitrogen])
- Przedmioty szkiełka z wgłębieniem (0.8 mm)
- Kryszalki (24 x 40 mm)
Inkubacja z przeciwciałem wtórnym i montowanie preparatu:
- Przemyć próbki 3 razy po 10 minut każdorazowo w 1x PBS
- Blokować próbki w 1x PBS (uzupełnionym o 2% albuminy surowicy bydlęcej) przez 1 (jedną) godzinę przed dodaniem przeciwciała wtórnego.
- Inkubować z przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym do odpowiedniego stężenia w 1X PBS w temperaturze pokojowej, w ciemności, bez wytrząsania, przez 3 (trzy) godziny.
- Przemyć próbki 3 razy po 10 minut każdorazowo w 1x PBS
- W razie potrzeby przeprowadzić barwienie kontrastowe poczek (np. barwienie jąder komórkowych DAPI [4',6-diamidino-2-phenylindole] rozcieńczonym w PBS przez 10 minut).
- Równowagować próbki (przez minimum 30 minut) w odpowiednim medium przed montowaniem.
- Przygotować preparat na szkiełku. Morfologia poczek uniemożliwia montowanie na płasko. Próbki montuje się w zagłębieniu szkiełka z wgłębieniem (szkiełka kroplowego) do obrazowania. Nalać 75-100ul medium montującego do wgłębienia. Na jednym szkiełku można zamontować kilka próbek.
- Przed montowaniem należy usunąć z próbek powłokę pocieki. Chwycić poszczególną powłokę pocieki w części przedniej, uważając, aby nie uchwycić wewnętrznej błony pocieki.
- Drugą parą pincet delikatnie chwycić wewnętrzną błonę pocieki za głowę i wyjąć ją z powłoki pocieki.
- Niezwłocznie przenieść próbkę do wgłębienia i kontynuować obróbkę kolejnych próbek.
- Za pomocą sondy lub pincety ułożyć próbki równomiernie we wgłębieniu, powierzchnią boczną skierowaną do góry. Pojawiające się pęcherzyki powietrza można usunąć za pomocą sondy.
- Delikatnie nałożyć szkiełko nakrywowe na próbki, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza
4. Reprezentatywne wyniki:
Próbki przygotowane zgodnie z niniejszym protokołem zachowują ogólną morfologię brzucha dorosłego osobnika. Stosy obrazów można rzutować w celu wygenerowania obrazu dwuwymiarowego lub zastosować rendering 3-D, aby zbadać topologię brzucha.
Rysunek 1. Produkty genów segmentacyjnych u poczwarki Drosophila. Ekspresję białka Wingless oraz Engrailed (En-gal4:uas-GFP) zwizualizowano 26 godzin po utworzeniu puparium (APF) przy użyciu przeciwciał mysich przeciwko Wg (4D4: Iowa Hybridoma Bank) oraz przeciwciał przeciwko GFP. Powiększenie 10x, strona przednia po lewej, strona grzbietowa u góry. Jądra komórkowe wybarwiono DAPI.
Wykonano projekcję stosów składających się z około 50 obrazów (ΔZ między przekrojami wynosi 2,5μm).
Dyskusja
Techniki przedstawione w tym filmie mogą być wykorzystywane do przygotowania poczek Drosophila z różnych etapów rozwoju. Poczeki przetwarzane w okresie od 24 h APF do 32 h APF są najbardziej podatne na utratę komórek z nabłonka. Stosowanie detergentów (takich jak Triton X-100 i Tween-20) podczas przedłużonych etapów inkubacji zwiększa prawdopodobieństwo utraty komórek, dlatego nie jest zalecane. Zamiast tego, jako detergent w początkowym etapie fixacji stosuje się kwas deoksylocholowy. Wszystkie kolejne etapy wykonuje się w 1X PBS bez detergentu. Ponadto, kołysanie próbek podczas przedłużonych etapów inkubacji zwiększa utratę komórek i należy go unikać.
Próbki można obrazować z wykorzystaniem technik mikroskopii konfokalnej. Jednak poczwarki Drosophila przetworzone zgodnie z opisanym protokołem mogą być również obrazowane przy użyciu systemu mikroskopii z ustrukturyzowanym oświetleniem, co pozwala uzyskać jakość obrazu porównywalną z technikami konfokalnymi.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z grantu przyznanego przez National Science Foundation.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereomikroskop do sekcji | |||
| Pinceta chirurgiczna | |||
| Skalpel chirurgiczny z ostrzami nr 11 | |||
| Szklane płytki z dziewięcioma wgłębieniami | Corning | 7220-85 | |
| Komora wilgotnościowa do hodowli poczek | |||
| 1X bufor fosforanowo-solny (PBS) | |||
| Skalpel chirurgiczny nr 11 | |||
| taśma dwustronna | |||
| Bufor do fiksacji: 1x PBS, 4% paraformaldehydu, 0,2% kwasu deoksycholowego (do permeabilizacji) | |||
| pipeta p100 lub p200 | |||
| Preparaty mikroskopowe z wgłębieniami (0,8 mm) |
Bibliografia
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
Przedruki i uprawnienia
