Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Barwienie przeciwciała pierwszorzędowego i biocytyny
(Dzień 1)
UWAGA: Poniższa procedura barwienia immunologicznego jest przeznaczona dla swobodnie pływających sekcji i wymaga ciągłego wytrząsania z niską prędkością (2 obroty/min, obr./min) na wytrząsarce dla wszystkich etapów inkubacji.
- Płukać chusteczkę 3x po 10 minut w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
UWAGA: 0,1 M PBS można kupić komercyjnie lub wyprodukować w laboratorium w następujący sposób (składniki na 1 l): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w 1 L dH2O.
UWAGA: Jeśli znany jest pożądany marker neurochemiczny, barwienie białka/peptydu można przeprowadzić jednocześnie z barwieniem biocytyną (kroki 1.2 - 1.4). Jeśli barwiesz tylko pod kątem biocytyny, przejdź do kroku 1.5.
- OPCJONALNIE: Blokuj 10% surowicą blokującą (BS; normalna surowica kozia (NGS) rozcieńczona w 0,3% Triton X-100 w PBS przez 1 godzinę w RT).
UWAGA: Każda studzienka powinna otrzymać taką samą objętość roztworu; zalecana objętość wynosi od 250 do 500 μL/studzienkę. Wybór surowicy blokującej opiera się na gatunkach, w których wytwarzane są przeciwciała drugorzędowe (e.g., NGS stosuje się do sprzężonego z barwnikiem anty-koziego przeciwciała (odpowiednie gatunki przeciwciał pierwszorzędowych)). Jeśli zajdzie potrzeba użycia przeciwciał drugorzędowych wyhodowanych u różnych gatunków do odcinków barwienia immunologicznego, należy włączyć 10% każdej normalnej surowicy do etapu blokowania (2) i 3% każdej normalnej surowicy do etapów inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
- (OPCJONALNIE) Inkubuj skrawki w przeciwciałie pierwotnym, CB1R (poliklonalny, świnka morska), z 0,3% Triton X-100 i 3% BS w 0,1 M PBS przy RT O/N. CB1R służy do identyfikacji ekspresji receptora kannabinoidowego typu 1.
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i nie jest wymagany do odsłonięcia wypełnienia biocytyną. Rysunek 2 ilustruje sekcję oznaczoną dla biocytyny i CB1R podczas pierwszego procesu barwienia. Inkubacja O/N w RT jest wystarczająca dla większości przeciwciał pierwszorzędowych; jednak niektóre przeciwciała pierwszorzędowe, w tym CB1R, wymagają 3 - 5 dni inkubacji. Jeżeli inkubacja musi być dłuższa niż 1 dzień, zaleca się inkubację w temperaturze 4 °C, ponieważ Triton X-100 może przenikać przez plastry i może prowadzić do rozpadu tkanki podczas długotrwałej inkubacji w temperaturze pokojowej. Włączyć kontrolę ujemną pozbawioną przeciwciała pierwszorzędowego w co najmniej jednej sekcji dla każdej serii doświadczeń jako kontrolę swoistości przeciwciała drugorzędowego. W przypadku kontroli ujemnych pomija się przeciwciało pierwszorzędowe, ale dodaje się 0,3% Triton X-100 w 0,1 M PBS i BS.
(Dzień 2)
- Przemyć skrawki mózgu 3x po 10 minut w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Inkubować skrawki w sprzężonym czerwonym barwniku streptawidyny (stężenie: 1:1,000; wzbudzenie: 594 nm z emisją w widzialnym widmie czerwonym) z 0,3% Triton X-100 i 3% BS w 0,1 M PBS w temperaturze 4 °C O/N w ciemności (owinięte w folię aluminiową), aby odsłonić biocytynę. OPCJONALNIE: Dołącz przeciwciało drugorzędowe, kozie przeciwciało przeciwko śwince morskiej (stężenie: 1:500; wzbudzenie: 488 nm i emisja na zielono), z powyższą inkubacją po opcjonalnej inkubacji pierwotnej w kroku 1.3.
UWAGA: Przeciwciało drugorzędowe będzie potrzebne tylko wtedy, gdy zostanie przeprowadzone opcjonalne barwienie przeciwciałami pierwszorzędowymi (krok 1.3). Aby uwidocznić biocytynę, zaleca się koniugat streptawidyna-fluorofor z widmem emisyjnym w kolorze czerwonym, ponieważ pomaga on uwidocznić drobniejsze aksony w szczegółach i z lepszym kontrastem (Ryc. 1 - 3).
(Dzień 3)
- Przemyć skrawki mózgu 3x po 10 minut w 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Aby zabezpieczyć fluorescencję i ułatwić ponowne barwienie w przyszłości, zamontuj sekcje w wodnym podłożu montażowym i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.
UWAGA: Najlepiej jest odciąć je tak wcześnie, jak to możliwe, aby uniknąć trudności z usunięciem lakieru z szkiełka, zarażenia pleśnią i odwodnienia tkanek z powodu wycieku medium montażowego ze szkiełka. Skażeniu mikrobiologicznemu można zapobiec, stosując 0,02% azydku sodu w PBS.
UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny i łatwopalny, gdy ma kontakt z wodą. Należy zapoznać się ze standardowymi procedurami operacyjnymi dotyczącymi obchodzenia się z niebezpiecznymi chemikaliami i ich usuwania.
(dni 4 - 7)
- Wykonaj obrazowanie konfokalne ze wzbudzeniem przy 594 i 488 nm oraz przy powiększeniu 20X lub 40X, aby ujawnić neurony wypełnione biocytyną w kolorze czerwonym i markery neurochemiczne (CB1R) w kolorze zielonym. Oceń wspólne etykietowanie (Rysunek 2).
- Ustaw ekspozycję aparatu na mniej niż 100 ms, aby uniknąć fotowybielania i uzyskać konfokalne stosy obrazów aksonalnych i dendrytycznych altan całego neuronu. Użyj konfokalnych stosów obrazów i pakietów oprogramowania do śledzenia neuronów, aby zrekonstruować morfologię neuronów.
