1. Przygotowanie biopsji ssania doodbytniczego (RSB) Sekcje
- Umieść biopsje ssące doodbytnicze w 4% paraformaldehydzie na 6 godzin, aby utrwalić tkankę. Użyj objętości utrwalacza 5 razy większej niż objętość tkanki.
- Odwodnić tkankę za pomocą patologicznego odwadniacza tkanek przez 11 godzin. Cały zaprogramowany proces składa się z następujących 5 kroków:
- Umieść chusteczkę w formaldehydzie i utrwalaj ją przez 1 godzinę.
- Umieść chusteczkę w 75% etanolu na 4 godziny.
- Umieść tkankę w absolutnym etanolu (dwie przemiany po 1 h każda).
- Umieść tkankę w absolutnym etanolu (dwie przemiany po 30 minut każda).
- Umieść tkankę w ksylenie (trzy zmiany po 1 h każda).
- Umieścić tkankę w wosku parafinowym (58-60 °C) (trzy zmiany po 1 h każda). Osadź tkanki RSB w blokach parafinowych.
- Przycinaj bloki parafiny za pomocą mikrotomu, aż tkanka zostanie całkowicie odsłonięta z pełną płaszczyzną przekroju.
- Pokrój bloki na odcinki 0,4 μm za pomocą mikrotomu.
- Umieść sekcje w wodzie o temperaturze 45-50 °C na kilka sekund każdy, aby umożliwić im rozłożenie się na płaskim talerzu.
- Przenieś skrawki parafiny na szkiełka.
- Piecz zjeżdżalnie w piekarniku o temperaturze 60 °C przez 3-5 godzin. Unikaj pieczenia zbyt długo, ponieważ może to prowadzić do utraty antygenów.
- Umieść odparafinowane szkiełka w ksylenie (2 zmiany po 15 minut każda).
- Uwodnić szkiełka w absolutnym etanolu, 95%, 80% i 75% etanolu przez 5 minut każda. Następnie płucz je w wodzie oczyszczonej metodą odwróconej osmozy (RO) przez kolejne 5 minut.
2. Pobieranie antygenu
- Wykonaj robocze rozcieńczenia do odzyskiwania kalretyniny, mieszając 4 ml buforu do odzyskiwania antygenu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) z 200 ml wody oczyszczonej z RO. Wykonaj robocze rozcieńczenia dla S100 i Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5), mieszając 1 ml buforu cytrynianu sodu z kwasem cytrynowym (100x) z 99 ml wody oczyszczonej RO.
UWAGA: Kalretynina może być pobierana preferencyjnie za pomocą roztworu do pobierania EDTA. Jednak bufor cytrynianu sodu z kwasem cytrynowym jest bardziej odpowiedni do odzyskiwania S100 i PGP9.5.
- Umieść szkiełka w słoiku do barwienia coplin. Napełnij słoik roztworem do pobierania i umieść go w podgrzanej wrzącej łaźni wodnej. Po gotowaniu przez 20 minut wyjmij słoik z łaźni wodnej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Proces schładzania trwa około 10 minut. Wyjmij szkiełka i delikatnie spłucz je solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Narysuj okrąg markerem wokół tkanki i przygotuj mokre pudełko do kolejnych zabiegów.
3. Blokowanie
- Rozcieńczenia robocze należy wykonać, mieszając 3 ml 30% H2O2 z 27 ml wody oczyszczonej RO.
- Kroplami upuść dwie lub trzy krople 3% roztworu H2O2 kroplami na tkankę, aby zablokować peroksydazy. Natychmiast dodaj roztwór H2O2, aby upewnić się, że nie wyleje się z okręgu. Zablokuj peroksydazy w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 20 minut.
- Delikatnie przepłukać szkiełka PBS (trzy płukania po 5 minut każde).
- Zatkać szkiełka na 20 minut w temperaturze 37 °C 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA, przygotowana przez zmieszanie 1,5 g proszku BSA z 30 ml wody oczyszczonej RO).
UWAGA: Blokowanie za pomocą 3% nadtlenku wodoru może zapobiec 95% niespecyficznych zabarwień, a blokowanie za pomocą 5% BSA może zapobiec pozostałym 5% niespecyficznym barwieniom. Połącz te dwie metody, aby uzyskać wiarygodny wynik.
4. Reakcja antygen-przeciwciało
- Usuń 5% BSA i dodaj 50 μl pierwszorzędowego przeciwciała (kalretyniny, S100 lub PGP9,5) do szkiełka. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Umyj szkiełko PBS (trzy razy po 3 minuty).
- Dodać 50 μl wzmacniacza polimeru (odczynnik A; patrz Tabela materiałów) do sekcji i inkubować przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Następnie umyj szkiełko PBS (trzy razy po 3 minuty).
- Dodać 50 μl przeciwciała drugorzędowego B (kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikom/mysim przeciwciałom IgG) do sekcji i inkubować przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Umyj sekcję PBS (trzy razy po 5 minut).
5. 3,3-diaminobenzydyna i barwienie hematoksyliną
- Dodać 850 μl wody oczyszczonej RO do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać odczynniki barwiące (patrz Tabela materiałów) w kolejności A, B i C. Dodać 50 μl każdego odczynnika, aby uzyskać łącznie 1 ml roztworu roboczego 3,3-diaminobenzydyny (DAB). Jeśli występują osady, użyj roztworu po filtracji.
- Dodaj kroplę roztworu roboczego DAB do sekcji tkanki i barwij przez 3-10 minut. Inkubować szkiełka w DAB w temperaturze pokojowej, aż do wykrycia brązowego zabarwienia. Uważnie monitoruj za pomocą mikroskopu jasnego pola. Roztwór roboczy DAB należy trzymać z dala od światła. Następnie myj szkiełko PBS przez 5 minut.
- Dodaj kroplę hematoksyliny, aby przeciwbarwić jądra przez około 1 minutę. Następnie trzymaj słoik z kopinem i myj go pod strużką wody przez około 30-40 s, aż nadmiar barwnika zostanie usunięty. Uważaj, aby nie uszkodzić skrawków tkanki.
- Zanurz szkiełka RSB w słoiku z kopiną zawierającym PBS na 25-30 s. Następnie różnicować w 1% kwasie solnym-etanolu przez 10 s. Myj szkiełka PBS przez 1 minutę.
- Odwodnić szkiełka w odwrotnej kolejności nawodnienia: 75%, 80%, 95% i etanol absolutny (po 5 minut).
- Wystaw szkiełka na działanie ksylenu (2 zmiany po 5 min każda).
- Zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą mocowania ultraclean. Poczekaj, aż szkiełka wyschną przed wizualizacją za pomocą mikroskopu.