Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie roztworów rozwarstwiających i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego
- Karbogeniczna woda ultraczysta (czyli woda filtrowana o rezystywności 18,2 MΩ·cm) z karbogenem (95% O2/5% CO2) przez 5 min za pomocą dyfuzorów pęcherzykowych z kamienia powietrznego (aeratory do akwariów).
Uwaga: Kamienie napowietrzające można podłączyć do regulatora zbiornika karbogenicznego za pomocą standardowe rurki silikonowe. Jeśli kamienie napowietrzające nie są dostępne, uszczelnij koniec silikonowej rurki i zrób małe otwory w uszczelce, aby gaz karbogeniczny mógł wydostać się na zewnątrz i skarbonować roztwór.
- Przygotuj roztwór preparacyjny, rozpuszczając substancje rozpuszczone z Tabela 1 w ultraczystej wodzie. Dodaj CaCl2 do roztworu, który był karbogenowany przez co najmniej 5 minut, aby pomóc mu się rozpuścić.
Uwaga: Alternatywnie, najpierw dodaj CaCl2, aby mógł łatwo rozpuścić się w nienasyconym roztworze. Roztwór w postaci płynnej powinien mieć 300 - 320 mOsm/l i pH 7,4 po nasyceniu karbogenem.
- Schłodzić roztwór preparacyjny do temperatury 0 - 4 °C. Pozostawić roztwór w lodówce na noc lub umieścić roztwór w zamrażarce na 1 godzinę i stale monitorować temperaturę.
Uwaga: Roztwór preparacyjny może być przechowywany do 3 nocy; Wyrzuć później.
- Roztwór preparacyjny należy karbonować przez 5 - 10 minut przed użyciem.
Uwaga: Idealnie byłoby, gdyby roztwór wyglądał jak błoto pośniegowe lub przechodził w błoto pośniegowe przed użyciem.
- Przygotuj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) gryzoni, rozpuszczając substancje rozpuszczone z Tabela 2 w ultraczystej wodzie. Roztwór ACSF należy skarbonować w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 35 °C, aż do użycia. Dodaj CaCl2 do roztworu, który był karbonowany przez co najmniej 5 minut, aby pomóc mu się rozpuścić.
Uwaga: Alternatywnie, najpierw dodaj CaCl2, aby mógł łatwiej rozpuścić się w nienasyconym roztworze. Roztwór w postaci płynnej powinien mieć 290 - 320 mOsm/L i pH 7,4 po nasyceniu karbogenem. Roztwory należy sporządzać w objętościach 1, 2 lub 4 litrów w zależności od czasu trwania eksperymentów. Przygotuj 4 litry na cały dzień (8 godzin) eksperymentów. ACSF powinien być codziennie przygotowywany na świeżo; Nie przechowuj go dłużej niż 1 d.
2. Sekcja myszy w celu pobrania tkanki mózgowej
- Zbierz wszystkie narzędzia i materiały niezbędne do sekcji zwierząt. Skonfiguruj przestrzeń roboczą, aby przygotować się do sekcji zwierząt.
- Sprawdź zbiornik karbogeniczny (95%O2/5%CO2), aby upewnić się, że nie jest pusty. Wymień butlę z gazem przed eksperymentami, jeśli pozostało ciśnienie mniejsze niż 500 psi.
- Skalibruj wibratom (krajalnicę do tkanek z wibracyjnym ostrzem) zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Dostosuj ustawienie wibratomu tak, aby amplituda cięcia wynosiła 1 mm, a prędkość cięcia wynosiła 0,12 mm/s.
Uwaga: Optymalne ustawienia mogą się różnić dla każdego pojedynczego wibrującego ostrza do tkanek; Jednak ogólnie rzecz biorąc, amplituda powinna być wysoka, a prędkość skrawania niska.
- Napełnij komorę inkubacyjną wycinków mózgu (, tj. , opiekun plasterków mózgu) ACSF i bąbelkuj ją karbogenem. Następnie umieścić komorę inkubacyjną w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C.
- Uzyskaj młodocianą mysz dowolnej płci, w wieku od 13 d (p13) do 21 d (p21, gdzie p0 jest datą urodzenia).
- Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu sodu (55 mg/kg masy ciała). Gdy mysz jest głęboko znieczulona, na co wskazuje brak odruchu szczypania palców u stóp, natychmiast użyj zatwierdzonego przez weterynarza narzędzia gilotynowego, aby odciąć głowę myszy jednym szybkim ruchem.
Uwaga: Przygotuj zastrzyk pentobarbitalu sodu zgodnie z procedurami zalecanymi przez wytyczne instytucji.
- Przytrzymaj nos myszy, aby ustabilizować odciętą głowę i delikatnie wykonaj nacięcie w linii środkowej, zaczynając między oczami myszy i na całej długości skóry głowy, aby odsłonić czaszkę. Upewnij się, że czaszka nie jest ściśnięta przez nacisk wywierany przez maszynkę do golenia. Użyj rogu krawędzi maszynki do golenia, aby zwiększyć precyzję cięcia.
- Rozsuń płaty skóry głowy myszy palcami, aby odsłonić czaszkę. Następnie użyj świeżego rogu krawędzi brzytwy, aby wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki; Zwróć szczególną uwagę, aby uniknąć kontaktu z korą mózgową.
- Włóż kleszczyki odłamkowe do oczodołów myszy, aby ustabilizować odciętą głowę i umieść ją na szalce Petriego wypełnionej zimnym (0 - 4 °C) roztworem preparacyjnym. Upewnij się, że głowa jest całkowicie zanurzona w roztworze preparacyjnym.
- Użyj drugiego zestawu kleszczy do odłamków, aby delikatnie oderwać skórę głowy myszy, usuń kość nosa, obierając ją, i usuń tył (stronę ogonową) czaszki.
Uwaga: Kość nosowa młodych myszy jest bardzo miękka i łatwo się łamie.
- Użyj mikroszpatułki, aby przeciąć nerwy wzrokowe, nerwy trójdzielne i rdzeń kręgowy. Następnie użyj mikroszpatułki, aby delikatnie oddzielić mózg od czaszki. Pozostaw mózg całkowicie zanurzony na szalce Petriego wypełnionej roztworem preparacyjnym.
3. Przygotowanie wycinków korowych z kory somatosensoryczno-ruchowej
- Napełnij tackę buforową wibratomu ~150 ml zimnego (0 - 4°C) roztworu preparacyjnego.
Uwaga: Opcjonalnie, trzymaj tackę buforową w zamrażarce, dopóki nie będzie to potrzebne do utrzymania niskiej temperatury podczas procedury krojenia.
- Przyklej tkankę mózgową myszy do stolika wibratomu (uchwyt na próbkę/tacę) za pomocą kleju błyskawicznego. W przypadku myszy odetnij małą część ogonową mózgu (i., móżdżek), aby można go było łatwo przykleić płasko do uchwytu na próbkę (pozwalając, aby rostralna strona mózgu była skierowana w stronę sufitu).
Notatka: Alternatywnie, poziome wycinki mózgu myszy można przygotować, przyklejając grzbietową stronę mózgu do uchwytu na próbki (brzuszna strona mózgu powinna być skierowana w stronę sufitu).
- Delikatnie umieść uchwyt próbki (z tkanką mózgową) w tacce buforowej. Upewnij się, że grzbietowa część mózgu jest skierowana w stronę ostrza wibratomu.
Notatka: Bardzo ważne jest, aby zminimalizować czas, w którym mózg jest wystawiony na działanie powietrza.
4. Cięcie i pobieranie tkanki mózgowej
- Pokrój mózg na plastry o grubości 450 μm, używając wibratomu w kierunku grzbietowym do brzusznego. Upewnij się, że mózg pozostaje całkowicie zakotwiczony w tacy na próbki podczas jej krojenia.
- Wykonaj pierwsze cięcie w mózgu myszy, aby usunąć opuszkę węchową. Następnie wykonuj kolejne cięcia, aż do zaobserwowania obszaru somatosensoryczno-motorycznego (znajdującego się mniej więcej w połowie drogi między opuszką węchową a bregmą).
Uwaga: Opcjonalnie pokrój mózg na cieńsze (200 μm) plasterki, aż ciało modzelowate pojawi się w widoku koronalnym mózgu, co wskazuje, że obszar somatosensoryczno-motoryczny jest blisko.
- Za pomocą pipety transferowej o szerokim otworze zebrać plastry koronalne (450 μm) zawierające obszar somatosensoryczno-motoryczny i zanurzyć je na szalce Petriego zawierającej zimny (0 - 4 °C) roztwór preparacyjny.
- Użyj nowej żyletki i odetnij nadmiar tkanki z plastrów. W przypadku wycinków koronalnych od myszy wykonaj poprzeczne cięcie tuż poniżej spoidła kory nowej (i.e., ciało modzelowate). Nie ciąć ruchem piłowania; Wystarczy docisnąć ostrze do tkanki i użyć szczoteczki do detali, aby delikatnie oddzielić tkankę. Upewnij się, że zminimalizujesz ruch wycinka koronalnego.
- Za pomocą pipety transferowej o szerokim otworze przenieś grzbietową część wycinków koronalnych, które zawierają korę nową (warstwa 1 - 6) na drugą szalkę Petriego wypełnioną ciepłym (35 °C) ACSF na chwilę (~1 s). Następnie niezwłocznie przenieś plastry do komory inkubacyjnej zawierającej ciepły (35 °C) karbogeniczny ACSF.
Uwaga: Celem transferu na szalkę Petriego za pomocą ACSF jest zminimalizowanie transferu roztworu rozwarstwiającego do komory inkubacyjnej podczas przenoszenia wycinków mózgu za pomocą pipety o szerokim otworze. Wykorzystaj wiele dołków w komorze inkubacyjnej, aby uporządkować różne wycinki mózgu.
- Wyrzuć resztę mózgu i tuszy zwierzęcej zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
5. Inkubacja i utrzymanie
- Pozostawić wycinki mózgu lekko zanurzone w komorze inkubacyjnej w temperaturze 35 °C na 30 minut. Następnie wyjąć komorę inkubacyjną z łaźni wodnej i pozostawić do powrotu do temperatury pokojowej (20 - 25 °C). Odczekaj 1 godzinę, aż wycinki mózgu zregenerują się przed wykonaniem zapisów elektrofizjologicznych.
Uwaga: Upewnij się, że pod wycinkami mózgu w komorze inkubacyjnej nie zbierają się pęcherzyki powietrza. Pęcherzyki powietrza to interfejsy powietrzne, które powodują uszkodzenie tkanek. Wycinki mózgu myszy można przechowywać przez 6 - 8 godzin w dobrze karbogenowanej komorze inkubacyjnej z ACSF.
6. Zapisy elektrofizjologiczne powierzchownej warstwy korowej
Uwaga: Zdarzenia Ictal są obserwowane w zewnątrzkomórkowych zapisach potencjału lokalnego pola (LFP) z wycinków mózgu. LFP wycinka mózgu można obserwować i rejestrować za pomocą komory typu interface lub systemu zanurzonej matrycy wieloelektrodowej (MEA).
- Użyj pipety transferowej o szerokim otworze lub szczoteczki do detali, aby przesunąć plasterek mózgu na nieco większy, wstępnie przycięty papier do soczewek, który jest utrzymywany na miejscu za pomocą pęsety dentystycznej. Przenieś papier do soczewek (na którym spoczywa wycinek mózgu) do komory nagraniowej i zabezpiecz go na miejscu za pomocą sitka harfowego.
- Przepuścić ciepły (35 °C), karbogeniczny perfuzat ACSF przez komorę zapisu nad wycinkiem mózgu z szybkością 3 ml/min (~1 kroplówka/s). Użyj termometru cyfrowego, aby upewnić się, że komora zapisu ma 33 - 36°C.
- Elektrody szklane o impedancji 1 - 3 MΩ wyciągnąć z rurki ze szkła borokrzemianowego (o średnicy zewnętrznej 1,5 mm) za pomocą ściągacza. Napełnij szklane elektrody ACSF (~10 μL) za pomocą strzykawki Hamiltona. Natychmiast wyrzuć elektrodę, jeśli końcówka jest uszkodzona.
Uwaga: Wybiel srebrny drut (5 minut) i pozwól, aby tylko minimalna część (, tj. , końcówka) srebrnego drutu została zanurzona w szklanych elektrodach ACSF, aby zminimalizować szumy i dryf podczas nagrań. W razie potrzeby usunąć nadmiar ACSF ze szklanej elektrody za pomocą strzykawki Hamiltona.
- Użyj mikroskopu stereoskopowego 20X, aby dokładnie wprowadzić szklaną elektrodę rejestrującą do powierzchownej warstwy kory mózgowej (2/3) za pomocą ręcznych manipulatorów. Nagrywaj/przeglądaj aktywność elektryczną wycinka mózgu na komputerze za pomocą standardowego oprogramowania.
Uwaga: Żywotne (wysokiej jakości) wycinki mózgu będą wykazywać silny potencjał wywołany w odpowiedzi na zastosowane bodźce elektryczne (100 μs, 30 - 300 μA) lub impulsy świetlne (30 ms, 10 mW/mm2) dla tkanki optogenetycznej.
7. Indukcja czynności podobnych do napadów padaczkowych
- Perfuzja ACSF zawierająca 100 μM 4-aminopirymidyny (4-AP) na wycinku mózgu. Rozpuścić 80 mg 4-AP w 8,5 ml wody, aby uzyskać roztwór podstawowy 100 mM 4-AP. Dodać 100 μl 100 mM roztworu podstawowego 4-AP do 100 ml ACSF, aby uzyskać perfuzat ACSF ze 100 μM 4-AP.
Uwaga: Alternatywnie, użyj Zero-Mg2+ ACSF (Tabela 3), zmodyfikowanego roztworu ACSF bez dodatku Mg2+, do perfuzji wycinka mózgu. Średni czas pojawienia się zdarzeń ictal wynosi 15 minut; Jednak w przypadku niektórych wycinków mózgu może to potrwać do 40 minut.
8. Generowanie napadów na żądanie: strategia optogenetyczna dla myszy optogenetycznych
- Zastosuj krótki (30 ms) impuls niebieskiego (470 nm) światła (o minimalnym natężeniu wyjściowym 1 mW/mm2), aby zainicjować zdarzenie ictal. Użyj ręcznego manipulatora, aby ustawić światłowód o średnicy rdzenia 1,000 μm (0,39 NA) bezpośrednio nad obszarem nagrywania.
Uwaga: Ustaw szybkość fotostymulacji tak, aby odpowiadała pożądanej szybkości występowania zdarzenia ictal (i., 1 impuls co 50 s). Nie można jednak nadmiernie przeceniać wskaźnika w stosunku do wewnętrznego tempa, w jakim zachodzą zdarzenia ictal.
Tabela 1: Przepis na roztwór preparacyjny. To są instrukcje, jak zrobić 1 l lub 2 l objętości. MW = masa cząsteczkowa substancji rozpuszczonej.
| # | Odczynnik | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | Sacharoza | 248 | 342.3 | 84.89 | 169.78 |
| 2 | Wodorowęglan sodu (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | Dekstroza (D-glukoza) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Chlorek potasu (KCl) | 2 | 74.55 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | Siarczan magnezu (MgSO4·7H2O) | 3 | 246.47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | Sodu fosforan jednozasadowy jednowodny (H2NaPO4·H2O) | 1.25 | 137.99 | 0.17 | 0.34 |
| 7 | Chlorek wapnia (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.15 | 0.29 |
Tabela 2: Przepis na sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) u gryzoni. To są instrukcje, jak zrobić objętości 2 L lub 4 L. MW = masa cząsteczkowa substancji rozpuszczonej.
| # | Odczynnik | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Chlorek sodu (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | Wodorowęglan sodu (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Dekstroza (D-glukoza) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Chlorek potasu (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Siarczan magnezu (MgSO4·H2O) | 1.3 | 246.47 | 0.64 | 1.28 |
| 6 | Sodu fosforan jednozasadowy jednowodny (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Chlorek wapnia (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.44 | 0.88 |
Tabela 3: Przepis na sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy dla gryzoni Zero-Mg2+ (Zero-Mg2+ ACSF). To są instrukcje, jak zrobić objętości 2 L lub 4 L. MW = masa cząsteczkowa substancji rozpuszczonej.
| # | Odczynnik | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Chlorek sodu (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | Wodorowęglan sodu (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Dekstroza (D-glukoza) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Chlorek potasu (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Siarczan magnezu (MgSO4·H2O) | Nominalnie darmowe | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | Sodu fosforan jednozasadowy jednowodny (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Chlorek wapnia (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.29 | 0.59 |