Wywoływanie ukierunkowanego uszkodzenia neuronów za pomocą lasera o dużej mocy u larwy Drosophila

1. Uszkodzenie dwufotonowe i obrazowanie konfokalne

1. Konfiguracja mikroskopu
   UWAGA: Do tego eksperymentu użyto konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z laserem dwufotonowym, ale inne systemy o równoważnej konfiguracji również wystarczą. Laser dwufotonowy (930 nm) został użyty do zadawania obrażeń, a laser argonowy (488 nm) został użyty do konfokalnego obrazowania GFP.
   1. Na początku każdej sesji włącz laser dwufotonowy i/lub laser konfokalny (lasery) konfokalny i mikroskop. Następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania.
   2. W przypadku uszkodzeń dwufotonowych należy ustawić następujące parametry obrazowania GFP za pomocą lasera dwufotonowego o długości fali 930 nm (1 950 mW).
      1. Wybierz tryb skanowania linii. Otwórz otwór do końca. Zwiększ intensywność lasera do ~20% (390 mW).
      2. Wybierz 512 x 512 jako skan klatek. Użyj maksymalnej szybkości skanowania (zwykle przy czasie zatrzymania piksela wynoszącym 0,77 μs). Upewnij się, że średnia liczba wynosi 1, a głębia bitowa wynosi 8 bitów.
      3. Ustaw wzmocnienie na ~750, a przesunięcie na 0.
      4. Zapisz ten wstępnie ustawiony protokół eksperymentalny jako ablację 2P GFP 930, co pozwoli na łatwe ponowne wykorzystanie w przyszłych eksperymentach.
   3. W przypadku obrazowania konfokalnego należy ustawić następujące parametry obrazowania GFP za pomocą lasera argonowego przy długości fali 488 nm:
      1. Wybierz kartę Akwizycja, a następnie Stos Z.
      2. W sekcji "Laser" włącz zasilanie lasera argonowego 488 nm.
      3. Przejdź do Kanały, wybierz laser 488 mm i zwiększ moc lasera do 5-10%. Do otworu użyj przewiewnej jednostki 1-2 (AU). Ustaw wzmocnienie na 650.
      4. W trybie akwizycji wybierz 1024 x 1024 jako skanowaną klatkę, użyj maksymalnej szybkości skanowania, średniej liczby 2 i głębi bitowej 8 bitów.
      5. Zapisz ten wstępnie ustawiony protokół eksperymentalny jako obrazowanie GFP (zielone białko fluorescencyjne).
2. Znieczulenie larw eterem dietylowym i mocowaniem
   1. W dygestorii umieść szklane naczynie o średnicy 60 mm w plastikowej szalce Petriego o średnicy 15 cm. Złóż i połóż kawałek bibuły na dnie szklanego naczynia, a następnie połóż na chusteczce talerz z agarem z sokiem winogronowym. Dodaj eter dietylowy do szklanego naczynia do punktu, w którym bibułka jest nasączona i w naczyniu pozostaje warstwa ciekłego eteru. Trzymaj pokrywę założoną przez cały czas.
   2. Przygotuj szkiełko z jedną kroplą oleju halocarbon 27 w środku. Dodaj 4 plamy smaru próżniowego na cztery rogi szkiełka, aby później podeprzeć szkiełko nakrywkowe.
   3. Za pomocą kleszczy podnieś oczyszczoną larwę i umieść ją na płytce agarowej w szklanym naczyniu o średnicy 60 mm. Przykryj szklane naczynie pokrywką i poczekaj, aż larwa przestanie się poruszać. W przypadku urazu/obrazowania PNS wyjmij larwę, gdy tylko jej ogon przestanie drgać. W przypadku OUN poczekaj, aż cała larwa stanie się nieruchoma, zwłaszcza segmenty głowy.
      UWAGA: Czas ekspozycji na eter ma kluczowe znaczenie. Zobacz Dyskusja.
   4. Ostrożnie podnieś znieczuloną larwę i umieść ją głową do pozycji pionowej w kropli oleju halowęglowego na zjeżdżalni. Dodaj szkiełko nakrywkowe na wierzchu szkiełka. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aż dotknie larwy (ryc. 1A).
   5. Dostosuj pozycję larwy, delikatnie popychając szkiełko nakrywkowe w lewo lub w prawo, aby zwinąć larwę, tak aby interesujący neuron/akson/dendryt znajdował się na górze i najbliżej soczewki mikroskopu.
   6. W przypadku uszkodzenia PNS zamontuj larwę grzbietową stroną do góry, tak aby obie tchawice były widoczne. Następnie obróć larwę ~ 30 stopni w lewo w celu uszkodzenia aksonów neuronów klasy III da (ryc. 1B i 1C), 90 stopni w celu uszkodzenia aksonów neuronów klasy IV da (ryc. 1B i 1E) lub ~ 30 stopni w celu uszkodzenia dendrytów neuronów klasy IV da.
   7. W przypadku uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego należy ustawić larwę tak, aby była idealnie brzusznie skierowana do góry, tak aby obszar zainteresowania znajdował się najbliżej soczewki mikroskopu w płaszczyźnie z.
3. Uraz spowodowany laserem dwufotonowym
   1. Umieść szkiełko z larwą pod mikroskopem i zabezpiecz je na miejscu za pomocą uchwytu szkiełka na stoliku. Użyj obiektywu 10X (0,3 NA), aby znaleźć larwę.
   2. Dodaj 1 kroplę oleju do obiektywów na szkiełko nakrywkowe, przełącz się na obiektyw 40X (1,3 NA) i wyreguluj ostrość.
   3. Przełącz się w tryb skanowania i ponownie użyj eksperymentalnego protokołu 2P GFP 930 Ablation. Upewnij się, że otwór jest całkowicie otwarty.
      UWAGA: Konfiguracja musi być zoptymalizowana w oparciu o poszczególne systemy.
   4. Uruchom tryb Na żywo, aby zlokalizować obszar zainteresowania (ROI) i dostosuj ustawienia, aby uzyskać dobrą jakość obrazu przy odpowiednim powiększeniu.
      UWAGA: Celem tego kroku jest znalezienie neuronu/aksonu/dendrytu, który ma zostać uszkodzony, a nie wykonanie obrazu o najlepszej jakości. Dlatego użyj minimalnych ustawień wystarczających do wizualizacji obszaru docelowego, aby uniknąć prześwietlenia lub fotowybielania.
   5. Zatrzymaj skanowanie na żywo, aby przycisk Przytnij stał się dostępny. Niech nieruchomy obraz posłuży jako mapa drogowa. Wybierz funkcję Crop (Przytnij) i dostosuj okno skanowania, aby ustawić ostrość na celu, który ma zostać zraniony.
   6. Zmniejsz zwrot z inwestycji, aby był rozmiarem potencjalnego miejsca urazu. Na przykład wystarczy pokryć szerokość aksonu lub dendrytu, aby zapewnić precyzję urazu i zmniejszyć uszkodzenia sąsiednich tkanek. W razie potrzeby powiększ ROI przed przycięciem, co pozwoli na dokładniejsze obrażenia.
   7. Otwórz nowe okno obrazowania. Zmniejsz prędkość skanowania i zwiększ intensywność lasera. Określ wzrost intensywności lasera na podstawie sygnału fluorescencji tkanek skanowanego w trybie Na żywo.
   8. Zazwyczaj ustawia się intensywność lasera dwufotonowego, zaczynając od 25% w przypadku uszkodzenia PNS i 50-100% w przypadku uszkodzenia VNC. W przypadku uszkodzenia aksonu PNS upewnij się, że natężenie lasera wynosi ~ 480 mW, a czas przebywania pikseli wynosi 8.19 μs. W przypadku uszkodzenia aksonu VNC upewnij się, że intensywność lasera i czas przebywania pikseli wynoszą zwykle odpowiednio 965-1930 mW i 8.19-32.77 μs.
   9. Rozpocznij skanowanie ciągłe. Pozostaw kursor najeżdżający na przycisk Ciągłe. Uważnie obserwuj obraz i przerwij skanowanie, gdy tylko zauważysz drastyczny wzrost fluorescencji.
      UWAGA: Pojawienie się kolca fluorescencji jest spowodowane autofluorescencją w miejscu urazu.
   10. Przełącz się z powrotem do trybu Na żywo, ponownie używając ustawień. Znajdź obszar zainteresowania, który właśnie został docelowy, dostosowując fokus.
       UWAGA: Dobrym wskaźnikiem udanego urazu jest pojawienie się małego krateru, struktury przypominającej pierścień lub zlokalizowanych odłamków w miejscu urazu.
   11. Przejdź do następnego neuronu i powtórz krok 1.3.5, aby uszkodzić wiele neuronów u jednego zwierzęcia. Lub powtórz krok 3.3.5, stopniowo zwiększając moc i/lub zmniejszając prędkość skanowania, jeśli początkowe obrażenia były niewystarczające.
       UWAGA: W przypadku, gdy moc lasera jest zbyt wysoka, na obrazie skanowania na żywo po urazie widoczny będzie duży uszkodzony obszar. Zbyt duże obrażenia mogą spowodować śmierć larwy.
   12. Odzyskaj larwę, ostrożnie usuwając szkiełko nakrywkowe i przenosząc zranioną larwę na nową płytkę z pastą drożdżową. Wykop kilka jaskiń na płycie agarowej za pomocą kleszczy; Alternatywnie, zrób wyspę agaru na płytce zamiast używać całej płytki, aby zmniejszyć możliwość wypełzania larwy z płytki.
   13. Umieść płytkę na 60-milimetrowej szalce Petriego z mokrą chusteczką (nasączoną 0,5% roztworem kwasu propionowego) i kulturą w temperaturze pokojowej lub 25°C.
       UWAGA: Larwa pozostanie w stadium larwalnym przez około dodatkowy dzień w temperaturze pokojowej (22°C) w porównaniu do 25°C.

Rysunek 1: Da regeneracja aksonów neuronów na peryferiach wykazuje specyficzność klasową. (A i B) Schematyczny rysunek przedstawiający położenie larw. (C) Schematyczny rysunek neuronów klasy III da. (D) Aksony neuronów klasy III da ddaF, znakowane 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, nie odrastają. (E) Schematyczny rysunek neuronów klasy IV da. (F) Aksony neuronów v'ada klasy IV da, znakowane ppk-CD4-tdGFP/+, odrastają poza miejsce uszkodzenia. (D i F) Czerwona linia wskazuje długość aksonu, podczas gdy zielona przerywana linia oznacza odległość między ciałem komórki a punktem zbieżnym aksonu (DCAC). Niebieska kropka oznacza punkt zbieżności aksonów. Podziałka = 20 μm.