1. Przygotowanie pożywek i odczynników
- Rozmrozić powłokę macierzy błony podstawnej dla płytek hodowlanych w temperaturze 4 °C (nie dopuścić do rozgrzania się matrycy błony podstawnej, ponieważ spowoduje ona zestalenie). Przygotuj 1 ml porcji i przechowuj je w temperaturze -20 °C lub -70 °C.
- Rozpuść zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w stężeniu 10 μg/ml i przygotuj 10 μl podwielokrotności. Przechowuj je w temperaturze 4 °C.
- Do nowej, nieotwartej, 500 ml butelki DMEM/F12 z glutaminą dodaj B27 (10 ml), N2 (5 ml) i penicylinę-streptomycynę (5 ml). Umieść 50 ml tej pożywki z nerwowych komórek macierzystych (NSC) w stożkowej probówce i dodaj 10 μl 10 μg/μL (2 μg/ml final) bFGF. Przechowywać pożywkę NSC (+) bFGF w temperaturze 4 °C.
- Aby przygotować (-) pożywkę bFGF, użyj tej samej receptury, jak opisano w kroku 1.3, ale nie dodawaj bFGF. Pożywka ta zostanie wykorzystana do różnicowania NSC do neuronów i do utrzymania kultur neuronalnych po różnicowaniu.
2. Konstrukty lentiwirusowe
UWAGA: Przed rozpoczęciem pracy z konstruktami lentiwirusowymi upewnij się, że laboratorium zostało zatwierdzone do stosowania środków o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Ponadto podczas pracy z wektorami lentiwirusowymi należy stosować kaptury hodowlane BSL-2, środki ochrony osobistej (PPE) i metody utylizacji.
- Uzyskać konstrukty tau zapakowane w lentiwirusa z preferowanego źródła.
3. Hodowla ludzkich nerwowych komórek macierzystych
UWAGA: NSC są zwykle wysiewane po 100 000–150 000 komórek/cm2, a większość dostępnych na rynku NSC jest sprzedawana jako 1 x 106 komórek/fiolkę. Protokół ten został zoptymalizowany dla 10-centymetrowych naczyń do hodowli komórkowych (chociaż można stosować inne rozmiary szalek); w związku z tym, jeśli stosowane są dostępne na rynku NSC, może być konieczne rozszerzenie NSC poprzez uprzednie wyhodowanie w sześciodołkowych szalkach, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do zasiania 10-centymetrowych szalek. Protokół ten można alternatywnie dostosować do różnych rozmiarów naczyń do hodowli komórkowych.
- W celu przygotowania płytek do hodowli komórkowych należy usunąć jedną podwielokrotność zamrożonej powłoki macierzy błony podstawnej dla płytek do hodowli komórkowych i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze 4 °C (podwielokrotności można umieścić w temperaturze 4 °C na noc w dniu poprzedzającym wysiewanie komórek). Dodać 385 μl powłoki macierzy błony podstawnej do 5 ml pożywki DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna.
UWAGA: 5 ml pożywki DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna wystarcza do pokrycia pojedynczej 10-centymetrowej płytki (1 ml tego roztworu do powlekania macierzy błony podstawnej wystarcza do pokrycia jednego dołka z sześciodołkowego naczynia). Alternatywnie, jeśli komórki mają być utrwalone i wybarwione immunologicznie lub wybarwione na tioflawinę, hoduj komórki na szklanych szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych szalkach hodowlanych.
- Utrzymuj pożywkę i powłokę matrycy w niskiej temperaturze przed i podczas dodawania ich do naczyń hodowlanych. Dodać powłokę macierzy błony podstawnej do szalek hodowlanych i umieścić płytki w inkubatorze (w temperaturze 37 °C) na 1 godzinę. W celu uzyskania optymalnego powlekania nie należy inkubować macierzy błony podstawnej dłużej niż lub krócej niż 1 godzinę. Po 1 godzinie odessać powłokę macierzy błony podstawnej z szalek kultur komórkowych. Upewnij się, że zbiega się to w czasie z przygotowaniem NSC do powlekania.
UWAGA: Jeśli komórki nie są rozmrażane z zamrożonych zapasów, pomiń krok 3.2 i kontynuuj krok 3.3.
- Jeżeli komórki są rozmrażane z zamrożonych zapasów NSC, należy pobrać fiolkę z zamrożonymi komórkami i ogrzać ją w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 37 °C, przesuwając fiolkę w przód i w tył w wodzie. Po rozmrożeniu spryskaj fiolkę 70% etanolem i umieść ją w kapturze do hodowli komórkowych. Przenieś komórki do ~10 ml pożywki DMEM/F12 + penicylina-streptomycyna i odwiruj probówkę w temperaturze pokojowej przy 1,000 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w pożywce NSC.
- Rozcieńczyć komórki w pożywce NSC, aby uzyskać odpowiednią gęstość wysiewu dla używanego naczynia do hodowli komórek.
UWAGA: Na przykład, jeśli NSC są posiewane na sześciodołkowej płytce - jedna studzienka na sześciodołkowej szalce hodowlanej ma powierzchnię 9 cm2 - do wysiewu potrzeba od 900 000 do 1 350 000 komórek. Tak więc jedna fiolka zawierająca 1 000 000 komórek może być ponownie zawieszona w 2 ml pożywki i dodana do pojedynczego dołka sześciodołkowego naczynia.
- Dodaj wystarczającą ilość komórek zawieszonych w pożywce NSC, aby wysiać szalki hodowlane pokryte matrycą błony podstawnej (100 000 komórek/cm2) i zmieniaj pożywkę co drugi dzień (jeśli używasz zamrożonego bulionu, zmieniaj pożywkę dzień po posiewaniu, a następnie co drugi dzień). Hoduj komórki, aż zlewają się w 75%–80%.
UWAGA: Komórki prawdopodobnie osiągną 75%-80% konfluencji wkrótce po posiewaniu, ale może to potrwać dłużej, jeśli używane są zamrożone zapasy.
- Gdy NSC zlewają się w 75%-80%, rozpocznij różnicowanie neuronów, usuwając pożywkę bFGF NSC (+) i zastępując ją pożywką NSC (-) bFGF. Hodować komórki w tej pożywce (wymieniając pożywkę co drugi dzień) przez co najmniej 4 tygodnie.
UWAGA: Komórki będą się dzielić przez kilka dni po wycofaniu bFGF; W związku z tym komórki mogą osiągnąć 90–100% konfluencji.
- Po 4 tygodniach hodowli komórki osiągną neuronalny los i będą gotowe do leczenia lentiwirusem.
4. Transdukcja i utrzymanie kultur neuronalnych
- Aby transdukować neurony za pomocą lentiwirusa, użyj liczby mian 3,4 x 105 jednostek transdukcyjnych/komórkę (100% zlewająca się 10-centymetrowa miska będzie zawierała ~10 milionów neuronów). Rozcieńczyć jednostki transdukowalne do wymaganego stężenia w pożywce do hodowli komórkowych i dodać je do komórek (użyć normalnej objętości pożywki do naczynia do hodowli komórkowych). Dwa dni po dodaniu lentiwirusa umyj komórki 1x świeżą (-) pożywką bFGF (bez lentiwirusa) i kontynuuj hodowlę w pożywce (-) bFGF jak zwykle.
- W leczeniu po lentiwirusie należy karmić transdukowane neurony, zmieniając pożywkę do hodowli komórkowych ([-] pożywkę bFGF) co drugi dzień. Utrzymuj komórki przez ~ 8 tygodni po transdukcji. Rutynowo wizualizuj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby zapewnić żywotność.
UWAGA: Rzadkość lub pęknięcia dendrytyczne są oznakami, że komórki nie są już zdolne do życia.
