Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowania
- Zmodyfikuj cewnik do żył obwodowych 16 G do intubacji. Aby zmodyfikować, należy skrócić igłę o 1 cm i zegnąć pozostałą igłę dystalną o 1 cm o 30° w kierunku zaworu iniekcyjnego. Usuń skrzydełka cewnika (wielokrotnego użytku).
- Aby wykonać sondę ciśnienia śródczaszkowego lub ICP, wytnij 20-milimetrowy kawałek rurki polietylenowej (średnica wewnętrzna (ID): 0,58 mm, średnica zewnętrzna (OD): 0,96 mm) i spal jeden koniec, aby uzyskać okrągłą płytkę, zachowując otwarty prześwit. Omiń rurkę polietylenową rurką silikonową o średnicy 1 mm (średnica zewnętrzna: 1.0 mm, średnica zewnętrzna: 3.0 mm) przed podłączeniem rurki silikonowej o średnicy wewnętrznej 10 mm (średnica zewnętrzna: 0.76 mm, średnica zewnętrzna: 2.4 mm) do końca rurki polietylenowej.
- Włącz laptopa i otwórz oprogramowanie do akwizycji danych. Skalibruj przetworniki ciśnienia krwi (BP) i ciśnienia śródmózgowego (ICP) oraz laserowy Doppler zgodnie z instrukcjami producenta.
- Przygotować aparat do analizatora parametrów krytycznych krwi.
UWAGA: Upewnij się, że w waporyzatorze jest wystarczająca ilość izofluranu.
- Włącz O2 i przepływ powietrza atmosferycznego. Ustaw przepływ O2 na 30% i powietrza atmosferycznego na 70%.
- Umieść poduszkę grzewczą i ustaw temperaturę na 37 °C.
2. Znieczulenie
- Umieść szczura w komorze anestezjologicznej o przepływie 30% O2 i 70% powietrza atmosferycznego. Podać 5% gazowego izofluranu do komory. Odpowiednie znieczulenie zajmie około 4 minut. Uważnie kontroluj oddech.
- Po znieczuleniu ułóż szczura w pozycji leżącej na ciężkiej płycie otoczonej gumową opaską. Umieść przednie zęby szczura poniżej gumowej opaski.
- Ostrożnie wyciągnij język za pomocą zakrzywionych kleszczy. Oczyść krtań bawełnianą końcówką. Umieść zewnętrzne światło w linii środkowej gardła, aby uwidocznić struny głosowe.
- Zaintubuj podczas wdechu za pomocą zmodyfikowanego cewnika do żył obwodowych 16 G. Po prawidłowym włożeniu zdejmij szpilkę. Podłączyć cewnik do respiratora.
UWAGA: Prawidłowe ułożenie rurki potwierdzają ruchy klatki piersiowej zsynchronizowane z częstością oddechów. Jeśli widoczne są ruchy brzucha, należy dokonać ekstubacji i ponownego wprowadzenia szczura do dzwonka znieczulającego. Nie powtarzaj procedury więcej niż trzy razy ze względu na ryzyko uszkodzenia dróg oddechowych.
- Po zaintubowaniu zwierzę powinno być poddawane sztucznemu oddychaniu z 30% O2 i 70% powietrza atmosferycznego. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1,5%-3% izofluranu. Dostosuj izofluran, aby utrzymać ciśnienie krwi w zakresie 80-100 mmHg.
- Utrzymuj objętość wdechu respiratora na poziomie 3 ml, a częstotliwość na poziomie 40-45 wdechów/min. Dostosuj objętość wdechu zgodnie z analizą gazometrii krwi.
- Wykonaj szew przez wewnętrzną tkankę miękką policzka za pomocą szwu 2-0. Zawiązać szew wokół rurki iniekcyjnej i zaworu iniekcyjnego cewnika do żył obwodowych, aby zapiąć cewnik.
- Przenieś szczura na pole operacyjne i ułóż go w pozycji leżącej z ogonem skierowanym w stronę chirurga.
- W razie potrzeby nałóż żel pod oczy, aby przeciwdziałać suchości oczu.
- Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia. Oceń i utrzymuj głębokość znieczulenia podczas operacji.
3. Cewnik ogonowy
- Zdezynfekuj proksymalne 3-4 cm ogona 0,5% etanolu chlorheksydyny.
UWAGA: Od teraz używaj mikroskopu operacyjnego według uznania chirurga.
- Wykonaj 15-20 mm nacięcie skóry w bliższym końcu ogona po stronie brzusznej. Uważaj, aby nie naciąć tętnicy.
- Poluzuj skórę od leżącej poniżej tkanki łącznej za pomocą zakrzywionych kleszczy.
- Ostrożnie penetruj powięź, odsłaniając tętnicę.
- Ostrożnie uwolnij tętnicę ogonową z leżącej pod nią tkanki za pomocą zakrzywionych kleszczy.
- Wsuń pod naczynie trzy czarne jedwabne nitki. Umieść jedną nić tak dystalnie, jak to możliwe i mocno zawiąż węzeł chirurgiczny wokół tętnicy. Przytrzymaj luźne końce nici hemostatem.
- Zawiąż dwie pozostałe nici luźno wokół tętnicy.
- Popchnij gwint proksymalny tak proksymalnie, jak to możliwe. Zastosuj hemostat, aby przytrzymać końce proksymalnej nici. Pociągnij hemostat lekko, ale na tyle, aby ograniczyć i zablokować przepływ krwi. Umieść hemostat na brzuchu.
- Przeciąć końcówkę cewnika pod kątem 45°. Wytnij ostry koniec, aby zapobiec penetracji ściany tętnicy.
- Za pomocą nożyczek Vannas wykonaj nacięcie tętnicy 1/3 średnicy tętnicy pod kątem 30°, 3-5 mm od węzła dystalnego.
- Wprowadzić cewnik do tętnicy za pomocą dwóch prostych kleszczy. Użyj jednych kleszczy do przytrzymania cewnika, a drugiej do ostrożnego pociągnięcia tętnicy nad cewnikiem.
- Wprowadzić cewnik w górę naczynia do węzła bliższego i poluzować węzeł od hemostatu. Wizualizuj przepływ krwi w cewniku. Przymocuj luźno środkową nić do cewnika.
- Kontynuuj wprowadzanie do, a jeśli to możliwe, tuż za punktem, w którym tętnica jest ponownie pokryta powięzią.
- Kontroluj umieszczenie cewnika i ewentualny wyciek poprzez przepłukanie solą fizjologiczną.
- Zapnij dwie proksymalne nici za pomocą węzłów chirurgicznych.
UWAGA: Pomiar ciśnienia krwi musi być pulpulny; Jeśli nie, cewnik nie jest prawidłowo umieszczony.
- Przymocuj cewnik na końcu nacięcia, zawiązując węzeł chirurgiczny za pomocą dystalnej nici.
- Zszyj nacięcie skóry luźno razem za pomocą dwóch niewchłanialnych szwów monofilamentowych 4-0. Uważaj, aby nie przebić cewnika.
UWAGA: Podczas operacji należy zwracać uwagę na amplitudę pulsacji. Jeśli jest niski, przepłucz cewnik solą fizjologiczną.
- Poluzuj cewnik tętniczy od przetwornika ciśnienia, aby umożliwić przepływ krwi w celu pobrania gazometrii. Umieść rurkę mikrokapilarną na końcu cewnika. Pozwól krwi spłynąć do probówki. Po pobraniu krwi ponownie podłącz cewnik do głowicy i przepłucz cewnik.
- Włożyć rurkę kapilarną do analizatora parametrów krytycznych krwi. Zmierz pH, pCO2 i pO2 i zanotuj je
UWAGA: W zależności od wartości gazometrii i ciśnienia krwi, zmień szybkość wentylacji. Jeśli średnie ciśnienie tętnicze (MAP) jest zbyt niskie, należy spróbować zmniejszyć szybkość przepływu izofluranu. Przetestuj odruchy, aby upewnić się, że głębokość znieczulenia jest odpowiednia.
4. Sonda ICP
- Umieść szczura w ramce stereotaktycznej. Ważne jest, aby ustawić szczura symetrycznie.
- Umieść cylindryczną poduszkę pod ramą stereotaktyczną, aby utworzyć przednie zgięcie szyi.
- Ogol skórę głowy, szyję i obszar za uszami szczura. Usuń zbędne włosy.
- Zdezynfekuj obszar 0,5% etanolu chlorheksydyny.
- Znieczulić miejscowo 0,7 ml 10 mg/5 μg/ml lidokainy z adrenaliną, wprowadzić igłę na ogonowym końcu czaszki w linii środkowej. Wstrzyknąć w mięśnie szyi za pomocą 0,3-0,4 ml. Resztę wstrzyknąć podskórnie wokół i przed bregmą.
- Wykonaj nacięcie skóry od nakłucia igły ~8 mm doogonowo w linii środkowej.
- Wytnij wszystkie mięśnie tępo warstwami, aby zidentyfikować błonę atlanto-occipital (trójkąt w kolorze marmuru doogonowo do czaszki w linii środkowej).
- Użyj retraktora Alm, aby powstrzymać mięśnie szyi. W razie potrzeby umieść zwijacz z zębami doogonowo.
- Sprawdź, czy sterylna sonda ICP jest podłączona do przetwornika ICP. Przepłucz sondę ICP solą fizjologiczną. Upewnij się, że w sondzie ICP nie ma pęcherzyków powietrza.
- Naciąć błonę piersiowo-potyliczną za pomocą igły o sile 23 G. Zrób otwór, aby przeciągnąć sondę ICP przez membranę.
- Delikatnie przełóż sondę przez błonę atlanto-occipital. Lekko pociągnij sondę i upewnij się, że pokazuje krzywą pulsacji w zakresie 0-5 mmHg. Jeśli nie, wyjmij sondę, sprawdź połączenie z przetwornikiem i potwierdź przepływ przez światło.
- Nałóż dwie krople kleju tkankowego. Przesuń silikonową rurkę o średnicy 1 mm do przodu do membrany i nałóż dodatkowy klej, aby zminimalizować ryzyko przemieszczenia sondy ICP.
- Wyjmij zwijacze (zwijacze).
- Wykonaj jeden poziomy szew materaca do głowowego końca nacięcia i jeden prosty szew przerywany do końca ogonowego za pomocą niewchłanialnego szwu monofilamentowego 4-0.
5. Umieszczenie igły i sondy laserowo-dopplerowskiej
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej tuż przed oczami, 15 mm doogonowo.
- Usuń tkankę łączną i mięśnie za pomocą kleszczy. Użyj końcówki sterylnego wacika bawełnianego jako rouginy, aby umożliwić identyfikację bregmy i szwów koronalnych.
- Umieść zwijacz Alm.
- Umieść igłę rdzeniową 25 G w ramie stereotaktycznej. Umieść igłę dokładnie na bregmie i zanotuj pozycję.
UWAGA: Umieść przegub linii środkowej ramy stereotaktycznej pod kątem 30° w kierunku zwierzęcia w płaszczyźnie pionowej.
- Wyjmij igłę z bregmy, przesuń ramkę o 65 mm do przodu, a następnie umieść igłę w linii środkowej, aby zaznaczyć miejsce wiercenia.
- Wiercić, aż opona twarda zostanie zidentyfikowana poniżej kości. Delikatnie usuń fragmenty kości za pomocą prostych kleszczy i wypełnij ubytek woskiem kostnym.
- Wywierć kolejny otwór 3-4 mm bocznie po prawej stronie bregmy i tuż przed szwem koronalnym dla Laser-Dopplera. Nie jest konieczne wiercenie przez całą kość. Uważaj, aby nie przeniknąć do opony twardej.
- Poszukaj naczyń, w których laser-doppler może zmierzyć przepływ krwi. Umieść laserowy doppler i sprawdź wartości. Wymagana jest minimalna wartość 100 jednostek fu. Wyjmij mikroskop (sztuczne światło).
- Jeśli wartości są nadal akceptowalne, dodaj jedną kroplę kleju, aby zamocować sondę.
- Sprawdź ponownie, aby potwierdzić, czy wartość przekracza 80 FU. Jeśli wartość jest niższa niż 80 FU, wyjmij sondę i zmień jej położenie, aby osiągnąć wartość powyżej 80 FU.
UWAGA: Wartość, FU, jest dowolną jednostką pokazującą mózgowy przepływ krwi (CBF).
6. Indukcja krwotoku podpajęczynówkowego (SAH)
- Delikatnie wbić igłę przez czaszkę w linii środkowej między półkulami, aż poczuje się opór podstawy czaszki. Cofnąć igłę o 1 mm, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie tuż przed skrzyżowaniem wzrokowym.
- Obrócić igłę o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, tak aby końcówka igły była skierowana w prawo, aby zapewnić najbardziej jednorodny wynik podczas wstrzykiwania krwi. Zdejmij szpilkę (Rysunek 1).
- Równowaga przez 15 minut i dostosuj poziom znieczulenia, aby uzyskać średnie ciśnienie tętnicze krwi w zakresie 80-100 mmHg.
- Wykonaj analizę gazometrii krwi. Dostosuj odpowiednio poziom znieczulenia.
- Pobrać 500 μl krwi z cewnika ogonowego za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z tępą igłą o sile 23 G.
- Wypełnij martwą przestrzeń komory igły rdzenia krwią, aby uniknąć wstrzyknięcia powietrza. Wyjąć igłę 23 G ze strzykawki wypełnionej krwią i upewnić się, że strzykawka zawiera 300 μl krwi.
- Podłączyć strzykawkę do igły do rdzenia kręgowego. Chwyć mocno i wstrzyknij krew ręcznie, aby przekroczyć MAP.
- Obserwuj gwałtowny wzrost ICP i gwałtowny spadek CBF na laptopie.
UWAGA: CBF powinien wynosić 50% lub mniej w porównaniu z wynikiem wyjściowym przez co najmniej 5 minut, aby operacja zakończyła się sukcesem, patrz Rysunek 2. Szczury pozorowane nie przechodzą kroków 6.1-6.7, pomijając w ten sposób wprowadzenie igły rdzeniowej do mózgu, minimalizując możliwy spontaniczny krwotok i jatrogenne uszkodzenie mózgu.
