Pomiar wielu parametrów mitochondrialnych w neuronach za pomocą cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Liang, K. X., i wsp. Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje znakowanie komórek neuronalnych przeciwciałami dla mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego, białka związanego z mitochondrialnym DNA i mitochondrialnego białka błony zewnętrznej, a następnie cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia ich poziomów.

Protokół

1. Pomiar cytometrii przepływowej podjednostek kompleksu MRC (mitochondrialny łańcuch oddechowy) i TFAM (mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A) w komórkach stałych

1. Pod koniec okresu hodowli odłączyć komórki (~10⁶) dodając odczynnik dysocjacji komórek; następnie osadzać i zbierać komórki w probówce o pojemności 15 ml. Przemyć komórki przez odwirowanie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (1x) dwukrotnie, odwirowując przy 300 × g przez 5 minut.
2. Utrwal komórki w 1,6% paraformaldehydzie (PFA) (1 ml 1,6% PFA w probówce o pojemności 15 ml) w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut. Przemyć komórki przez odwirowanie z PBS (1x) dwukrotnie, wirując przy 300 × g przez 5 minut.
3. Przepuszczaj komórki lodowatym 90% metanolem (1 ml 90% metanolu w probówce o pojemności 15 ml) w temperaturze -20 °C przez 20 minut.
4. Zablokować próbki w buforze blokującym zawierającym 0,3 M glicyny, 5% surowicy koziej i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) - frakcja V w PBS (1x) (1 ml buforu blokującego w probówce o pojemności 15 ml). Umyć komórki przez odwirowanie z PBS (1x) dwukrotnie.
5. Inkubować komórki z następującymi pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 30 minut: anty-NDUFB10 (1:1,000) do pomiaru podjednostki kompleksu I, kompleksu dehydrogenazy antybursztynianowej podjednostki flawoproteinowej A (SDHA, 1:1,000) do pomiaru podjednostki kompleksu II i anty-COX IV (1:1,000) do pomiaru podjednostki kompleksu IV oraz przeciwciała anty-TFAM (mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A) sprzężone z Alexa Fluor 488 (1:400). Wybarwić tę samą liczbę komórek oddzielnie przeciwciałem anty-TOMM20 (translokaza zewnętrznej błony mitochondrialnej 20) sprzężonym z Alexa Fluor 488 (1:400) przez 30 minut (1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w probówce o pojemności 15 ml; szczegółowe informacje na temat przeciwciał można znaleźć w Tabeli materiałów ).
6. Przemyć komórki PBS (1x) raz z odwirowaniem w temperaturze 300 × g przez 5 minut. Dodać przeciwciało wtórne (1:400) do probówek z NDUFB10, SDHA i COX IV i inkubować komórki z tymi roztworami przez 30 minut.
7. Przemyć komórki PBS (1x) raz, odwirowując w temperaturze 300 × g przez 5 minut. Odessać supernatanty, pozostawiając około 100 μl w probówkach. Zawiesić osady komórkowe w 300 μl PBS (1x). Przenieść komórki do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml trzymanych w ciemności na lodzie.
8. Przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym (z konfiguracją 3 niebieskich i 1 czerwonego lasera). Wykrywanie sygnałów w filtrze 1 (FL1) za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 530/30.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
anty-TFAM sprzężony z Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Przeciwciało pierwotne; stosować w proporcji 1:400, 2,5 μl w 1000 μl roztworu barwiącego; użyj mysiego monoklonalnego IgG2b Alexa Fluor® 488 jako kontroli izotypu.
anty-TOMM20 sprzężony z Alexa Fluor 488	Biotechnologia Santa Cruz	Kot# sc-17764 RRID:AB_628381	Przeciwciało pierwotne; stosować w proporcji 1:400, 2,5 μl w 1000 μl roztworu barwiącego; użyj mysiego monoklonalnego IgG2a Alexa Fluor® 488 jako kontroli izotypu.
anty-NDUFB10	Abcam	ab196019	Przeciwciało pierwotne; stosować w proporcji 1:1000, 1 μl w 1000 μl roztworu barwiącego; użyj Alexa Fluor 488 ® kozi anty-króliczy IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne; stosować królicze monoklonalne IgG jako kontrolę izotypu.
anty-SDHA	Abcam	ab137040	Przeciwciało pierwotne; stosować w proporcji 1:1000, 1 μl w 1000 μl roztworu barwiącego; użyj Alexa Fluor 488 ® kozi anty-króliczy IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne; stosować królicze monoklonalne IgG jako kontrolę izotypu.
anty-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Przeciwciało pierwotne; stosować w proporcji 1:1000, 1 μl w 1000 μl roztworu barwiącego; użyj koziego anty-mysiego przeciwciała IgG Alexa Fluor ® 488 (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11001) jako przeciwciało wtórne; używać mysiej monoklonalnej IgG jako kontroli izotypu.
PBS 1x	Thermo Fisher Naukowy	18912014	Używany do etapów mycia
Formaldehyd (PFA) 16%	Thermo Fisher Naukowy	28908	Utrwalanie komórek
Glicyna	Sigma-Aldrich	G8898	Używany w buforze blokującym
Albumina surowicy bydlęcej	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Środek blokujący zapobiegający nieswoistemu wiązaniu przeciwciał w testach immunologicznych i składniku CDM