$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Pomiar cytometrii przepływowej podjednostek kompleksu MRC (mitochondrialny łańcuch oddechowy) i TFAM (mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A) w komórkach stałych
- Pod koniec okresu hodowli odłączyć komórki (~106) dodając odczynnik dysocjacji komórek; następnie osadzać i zbierać komórki w probówce o pojemności 15 ml. Przemyć komórki przez odwirowanie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (1x) dwukrotnie, odwirowując przy 300 × g przez 5 minut.
- Utrwal komórki w 1,6% paraformaldehydzie (PFA) (1 ml 1,6% PFA w probówce o pojemności 15 ml) w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut. Przemyć komórki przez odwirowanie z PBS (1x) dwukrotnie, wirując przy 300 × g przez 5 minut.
- Przepuszczaj komórki lodowatym 90% metanolem (1 ml 90% metanolu w probówce o pojemności 15 ml) w temperaturze -20 °C przez 20 minut.
- Zablokować próbki w buforze blokującym zawierającym 0,3 M glicyny, 5% surowicy koziej i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) - frakcja V w PBS (1x) (1 ml buforu blokującego w probówce o pojemności 15 ml). Umyć komórki przez odwirowanie z PBS (1x) dwukrotnie.
- Inkubować komórki z następującymi pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 30 minut: anty-NDUFB10 (1:1,000) do pomiaru podjednostki kompleksu I, kompleksu dehydrogenazy antybursztynianowej podjednostki flawoproteinowej A (SDHA, 1:1,000) do pomiaru podjednostki kompleksu II i anty-COX IV (1:1,000) do pomiaru podjednostki kompleksu IV oraz przeciwciała anty-TFAM (mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A) sprzężone z Alexa Fluor 488 (1:400). Wybarwić tę samą liczbę komórek oddzielnie przeciwciałem anty-TOMM20 (translokaza zewnętrznej błony mitochondrialnej 20) sprzężonym z Alexa Fluor 488 (1:400) przez 30 minut (1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w probówce o pojemności 15 ml; szczegółowe informacje na temat przeciwciał można znaleźć w Tabeli materiałów ).
- Przemyć komórki PBS (1x) raz z odwirowaniem w temperaturze 300 × g przez 5 minut. Dodać przeciwciało wtórne (1:400) do probówek z NDUFB10, SDHA i COX IV i inkubować komórki z tymi roztworami przez 30 minut.
- Przemyć komórki PBS (1x) raz, odwirowując w temperaturze 300 × g przez 5 minut. Odessać supernatanty, pozostawiając około 100 μl w probówkach. Zawiesić osady komórkowe w 300 μl PBS (1x). Przenieść komórki do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml trzymanych w ciemności na lodzie.
- Przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym (z konfiguracją 3 niebieskich i 1 czerwonego lasera). Wykrywanie sygnałów w filtrze 1 (FL1) za pomocą filtra pasmowoprzepustowego 530/30.