Pomiar wielu parametrów mitochondrialnych w neuronach za pomocą cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Liang, K. X., i wsp. Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje znakowanie komórek neuronalnych przeciwciałami dla mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego, białka związanego z mitochondrialnym DNA i mitochondrialnego białka błony zewnętrznej, a następnie cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia ich poziomów.

Protokół

1. Pomiar cytometrii przepływowej podjednostek kompleksu MRC (mitochondrialny łańcuch oddechowy) i TFAM (mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A) w komórkach stałych

1. Pod koniec okresu hodowli odłączyć komórki (~10⁶) dodając odczynnik dysocjacji komórek; następnie osadzać i zbierać komórki w probówce o pojemności 15 ml. Przemyć komórki przez odwirowanie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (1x) dwukrotnie, odwirowując przy 300 × g przez 5 minut.
2. Utrwal komórki w 1,6% paraformaldehydzie (PFA) (1 ml 1,6% PFA w probówce o pojemności 15 ml) w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut. Przemyć komórk....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
anty-TFAM sprzężony z Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Przeciwciało pierwotne; stosować w proporcji 1:400, 2,5 μl w 1000 μl roztworu barwiącego; użyj mysiego monoklonalnego IgG2b Alexa Fluor® 488 jako kontroli izotypu.
anty-TOMM20 sprzężony z Alexa Fluor 488	Biotechnologia Santa Cruz	Kot# sc-17764 RRID:AB_628381	Przeciwciało pierwotne; stosować w proporcji 1:400, 2,5 μl w 1000 μl roztworu barwiącego; użyj mysiego monoklonalnego IgG2a Alexa Fluor® 488 jako kontroli izotypu.
anty-NDUFB10	Abcam	ab196019	Przeciwciało pierwotne; stosować w proporcji 1:1000, 1 μl w 1000 μl roztworu barwiącego; użyj Alexa Fluor 488 ® kozi anty-króliczy IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne; stosować królicze monoklonalne IgG jako kontrolę izotypu.
anty-SDHA	Abcam	ab137040	Przeciwciało pierwotne; stosować w proporcji 1:1000, 1 μl w 1000 μl roztworu barwiącego; użyj Alexa Fluor 488 ® kozi anty-króliczy IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne; stosować królicze monoklonalne IgG jako kontrolę izotypu.
anty-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Przeciwciało pierwotne; stosować w proporcji 1:1000, 1 μl w 1000 μl roztworu barwiącego; użyj koziego anty-mysiego przeciwciała IgG Alexa Fluor ® 488 (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11001) jako przeciwciało wtórne; używać mysiej monoklonalnej IgG jako kontroli izotypu.
PBS 1x	Thermo Fisher Naukowy	18912014	Używany do etapów mycia
Formaldehyd (PFA) 16%	Thermo Fisher Naukowy	28908	Utrwalanie komórek
Glicyna	Sigma-Aldrich	G8898	Używany w buforze blokującym
Albumina surowicy bydlęcej	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Środek blokujący zapobiegający nieswoistemu wiązaniu przeciwciał w testach immunologicznych i składniku CDM